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光電關(guān)聯(lián)顯微技術(shù) (CLEM)
想象一下,您可以輕松彌合微米和納米兩種尺度之間的差距,連接功能性和超微結(jié)構(gòu)的信息。對于特定的研究問題,這意味著采用不同的樣本制備和顯微成像技術(shù)來結(jié)合多種模式,如活細胞成像、高壓冷凍、超薄切片和(冷凍)電子顯微成像。CLEM方法有助于彌合這一差距。
徠卡顯微系統(tǒng)的CLEM解決方案可確保樣本活性、進行質(zhì)量檢查,確保三維目標定位機制精確可靠。用戶可以利用這些解決方案的優(yōu)勢,在合適的時間立即識別合適的細胞,獲得高分辨率的冷凍共聚焦數(shù)據(jù),或?qū)晒庑畔⑴c超微結(jié)構(gòu)環(huán)境結(jié)合起來。
CLEM的用途是什么?
CLEM方法用于以亞納米分辨率進一步研究樣本,不僅能將一個區(qū)域內(nèi)各層的信息結(jié)合起來,還能對基體中的感興趣區(qū)域進行特異定位——就像在黑暗中摸索時有了燈塔一樣。
例如,可使用冷凍熒光顯微鏡對標記蛋白輕松檢測和定位,然后用冷凍電鏡作進一步的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析。再比如說,您想要將動態(tài)信息(如細胞間相互作用)與結(jié)構(gòu)信息結(jié)合起來,超越光分辨率的限制。
不過,雖然聽起來很容易,但要順利地創(chuàng)建一個成功的(冷凍)CLEM工作流程會面臨許多挑戰(zhàn)。早在實驗設計階段,用戶就應該考慮以下問題:
如何制備樣本并使其保持最佳狀態(tài)?
如何識別和標記感興趣的目標結(jié)構(gòu)?
如何在儀器之間安全高效地傳送樣本?
如何以合適的格式提供成像和目標數(shù)據(jù),以便執(zhí)行后續(xù)的電鏡步驟?
Coral系列可幫助您逐步處理樣本,確保CLEM工作流程具有更高的可靠性。
如何將CLEM數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)起來?
無論是室溫還是冷凍CLEM實驗,光電關(guān)聯(lián)顯微成像對實驗的成功都至關(guān)重要。必須建立坐標系,而且在不同的成像模式中都能很好地被識別。然后,通過圖像擬合(用大視野預覽數(shù)據(jù))或絕對位置坐標(x、y、z值)疊加成像信息,用于高精度檢索高分辨率信息。
Cryo-CLEM是什么?
在Cryo-CLEM(冷凍光電關(guān)聯(lián)顯微技術(shù))中,兩個成像步驟都在冷凍條件下進行,這意味著需要可靠的冷凍樣本制備工作流程。該流程包括可靠的樣本玻璃化冷凍、安全的樣本轉(zhuǎn)移和穩(wěn)定的冷凍光學成像。應特別注意冰污染:高濕度環(huán)境和含冰污染的液氮容易導致樣本處于風險之中。Coral Cryo可以:
安全清潔地處理樣本;
確保穩(wěn)定、長期的冷凍光學成像;
使用Coral Cryo軟件在生物分子的原生環(huán)境中對生物分子進行成像和精確定位。
Coral Life工作流程簡介
熒光活細胞成像是一種廣泛使用的長時間細胞活動成像方式。然而,在有些情況下,通過光學顯微鏡獲取的信息還不足以幫助用戶深入了解細胞機制。在這種情況下,自然需要用RT常溫電鏡以高分辨率生成超微結(jié)構(gòu)圖像。
使用徠卡顯微系統(tǒng)的Coral Life工作流程,您可以在安全合適的生理環(huán)境中通過熒光顯微鏡對罕見的細胞事件進行跟蹤和成像。一旦發(fā)生感興趣的事件,您可最快在短短五秒內(nèi)將樣本玻璃化冷凍,然后在RT常溫電鏡(如:透射電鏡、掃描電鏡、FIB聚焦離子束掃描電鏡)中進一步分析。
它簡化了整個工作流程中的樣本轉(zhuǎn)移:從精心維護的細胞培養(yǎng)環(huán)境,到熒光成像,再到用高壓冷凍方式快速玻璃化冷凍。Coral Life的“活細胞到玻璃化冷凍"工作流程可在發(fā)生罕見細胞事件時捕捉事件,使其可用于電鏡分析。
Coral Cryo工作流程簡介
冷凍電子顯微成像已成為結(jié)構(gòu)生物學極其重要的技術(shù)之一。它可以揭示蛋白質(zhì)在其自然狀態(tài)下,通常是多構(gòu)象狀態(tài)下的結(jié)構(gòu),而X射線晶體學成像則無法提供此類重要信息。
將來自冷凍電鏡的超微結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)與使用STELLARIS Cryo獲得的高精度共聚焦目標定位數(shù)據(jù)兩者相結(jié)合,這是一種強大的Cryo-CLEM方法。徠卡顯微系統(tǒng)的冷凍光電關(guān)聯(lián)顯微成像工作流程Coral Cryo則優(yōu)化了硬件和軟件,實現(xiàn)兩種成像模式之間的平穩(wěn)轉(zhuǎn)換。
Coral Cryo與全面的Cryo-EM樣本制備產(chǎn)品系列相結(jié)合,旨在滿足Cryo-CLEM和Cryo-ET用戶群體中日益增長的需求,提高這類實驗的成功率。
用淡藍色(Hoechst,細胞核)、綠色(MitoTracker Green,線粒體)、紅色(Bodipy,脂滴)標記的LNG-non-LNGHeLa細胞。白色 – 熒光珠,反射模式 – 網(wǎng)格比例尺。
細胞由德國海德堡歐洲分子生物學實驗室Mahamid團隊的Ievgeniia Zagoriy提供。