本文介紹了對(duì)培養(yǎng)貼壁細(xì)胞系進(jìn)行傳代的一般工作流程及步驟說(shuō)明。哺乳類細(xì)胞體外培養(yǎng)是在癌癥、藥物開(kāi)發(fā)、組織工程、干細(xì)胞、疾病細(xì)胞和分子生物學(xué)等生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域進(jìn)行臨床和藥物研究的重要模型。要想成功維持細(xì)胞系，需要通過(guò)控制生長(zhǎng)條件來(lái)維持細(xì)胞生理和表型的穩(wěn)定性。定期監(jiān)測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)以確保連續(xù)性。

哺乳類細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)臨床和藥物研究與應(yīng)用至關(guān)重要，其可用于構(gòu)建靈活的健康和疾病模型系統(tǒng)。例如在機(jī)能研究可支持電腦模擬分析并可用于替代動(dòng)物模型。

細(xì)胞增殖取決于細(xì)胞類型（從動(dòng)物組織分離的原代細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、自我更新細(xì)胞、穩(wěn)定永生化細(xì)胞系、轉(zhuǎn)化細(xì)胞）和培養(yǎng)條件（培養(yǎng)基、2D/3D細(xì)胞外基質(zhì)、溫度、PH值、CO2/O2濃度）。在最佳培養(yǎng)條件下可以培養(yǎng)出用于各種實(shí)驗(yàn)分析的細(xì)胞。隨著動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的進(jìn)步，細(xì)胞系逐步演變并被用于疫苗生產(chǎn)、治療性蛋白、藥物制劑和抗癌制劑。

要想成功維持哺乳類細(xì)胞系，必須在受控條件下培養(yǎng)細(xì)胞并使用特定培養(yǎng)基。此外，為保證細(xì)胞生理和表型的穩(wěn)定性，必須定期監(jiān)測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)狀況。通常情況下，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到80%左右，須對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，以確保細(xì)胞生長(zhǎng)良好且健康。細(xì)胞匯合度達(dá)80%指的是培養(yǎng)皿80%的表面被細(xì)胞所覆蓋。注意：傳代培養(yǎng)細(xì)胞的最佳匯合度取決于細(xì)胞類型且可能還需優(yōu)化。

步驟1

從培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞并放在顯微鏡下快速檢查。應(yīng)每天進(jìn)行顯微鏡檢查，確保細(xì)胞處于健康狀態(tài)（無(wú)污染、死亡細(xì)胞少）并按預(yù)計(jì)生長(zhǎng)。

在培養(yǎng)貼壁細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞應(yīng)主要附著在培養(yǎng)皿活燒瓶底部，培養(yǎng)基應(yīng)呈粉橙色。由于培養(yǎng)基中細(xì)胞代謝物（或污染）導(dǎo)致酸化，因此酸堿指示劑酚紅呈黃色。由于培養(yǎng)基中細(xì)胞代謝物（或污染）導(dǎo)致酸化，因此酸堿指示劑酚紅呈黃色。在正常明場(chǎng)照明下難以觀察到這些細(xì)胞。切換至相差可以使細(xì)胞更容易被觀察到。如圖所示，使用DMi1，只需移動(dòng)聚光鏡環(huán)的滑塊即可選擇相差。

記錄細(xì)胞狀態(tài)對(duì)確保各實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致十分重要。DMi1可配備攝像頭和屏幕，通過(guò)遠(yuǎn)程控制輕松實(shí)現(xiàn)成像和保存。研究人員使用Mateo TL集成攝像頭可以拍攝細(xì)胞圖像，追蹤培養(yǎng)基狀況，將圖像轉(zhuǎn)存智能設(shè)備或U盤。

比較狗腎臟細(xì)胞在明場(chǎng)照明和相差圖像中的顯示效果：相差圖像的概覽效果更好，更易于檢查細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞計(jì)數(shù)。

步驟2

用移液器將培養(yǎng)基吸取至廢物容器中。也可以使用接有真空吸液器的移液器。

使用5ml不含鈣鎂的預(yù)熱PBS緩沖液仔細(xì)沖洗細(xì)胞，沖洗3次，去除殘留培養(yǎng)基中的胎牛血清。胎牛血清及其替代物會(huì)抑制胰蛋白酶。加入3ml預(yù)熱胰蛋白酶/乙二胺四乙酸，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿使其均勻覆蓋培養(yǎng)皿底部的細(xì)胞。在37°C下培育幾分鐘即可傳代細(xì)胞。

 不同細(xì)胞系需要的胰蛋白酶培養(yǎng)時(shí)間不同。為避免過(guò)度胰蛋白酶化使細(xì)胞受損，每隔幾分鐘在顯微鏡下檢查一次細(xì)胞。

輕柔地沖洗培養(yǎng)皿，并將細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移至50ml試管中，以800rpm的速度轉(zhuǎn)動(dòng)5分鐘使細(xì)胞沉降下來(lái)。吸走上層清液并在10ml新鮮培養(yǎng)基中重懸細(xì)胞，去除胰蛋白酶。

分離出的細(xì)胞應(yīng)呈圓形并在胰蛋白酶溶液中自由漂浮。細(xì)胞一經(jīng)分離，即向培養(yǎng)皿中加入5ml培養(yǎng)基，滅活胰蛋白酶。

步驟3

將100µL細(xì)胞懸浮液與等量的0.4%臺(tái)盼藍(lán)溶液混合。臺(tái)盼藍(lán)選擇性滲入死亡細(xì)胞的細(xì)胞膜并將其染藍(lán)，但不會(huì)被活細(xì)胞吸收。將蓋玻片置于計(jì)數(shù)表面上，準(zhǔn)備好血球計(jì)。

將移液器吸嘴置于蓋玻片邊緣輕輕擠出細(xì)胞懸浮液，將其滴加在計(jì)數(shù)室上（單位面積約4µl）。蓋玻片下的整片區(qū)域發(fā)生毛細(xì)管作用。大多數(shù)情況下，計(jì)數(shù)室有兩個(gè)計(jì)數(shù)區(qū)可各自承接液體。

將計(jì)數(shù)室放在顯微鏡載物臺(tái)上并將焦點(diǎn)集中在細(xì)胞上。方形計(jì)數(shù)網(wǎng)格樣式依計(jì)數(shù)室類型而定。圖中所示的Fuchs-Rosenthal血細(xì)胞計(jì)數(shù)板有16個(gè)區(qū)域，每個(gè)區(qū)域1平方毫米，整體被線包圍。每個(gè)正方形區(qū)域被細(xì)分為16個(gè)小正方形。如圖所示，計(jì)算一個(gè)區(qū)域內(nèi)16個(gè)正方形中的細(xì)胞總數(shù)。為避免重復(fù)計(jì)算位于大正方形邊線上的細(xì)胞，僅計(jì)算位于正方形兩條邊上的細(xì)胞。在本例中，觸及正方形上方和左側(cè)標(biāo)紅邊線（加粗紅線）的細(xì)胞應(yīng)被計(jì)入。觸及下方和右側(cè)紅色邊線的細(xì)胞應(yīng)不被計(jì)入。計(jì)算計(jì)數(shù)室5個(gè)1平方毫米區(qū)域內(nèi)的活細(xì)胞和死亡細(xì)胞。要計(jì)算最終結(jié)果，需要合計(jì)5個(gè)正方形的計(jì)數(shù)結(jié)果。為求得更精確的測(cè)算結(jié)果，也可以計(jì)算計(jì)數(shù)室其他正方形（大于5個(gè)）的細(xì)胞數(shù)量。

使用以下公式可計(jì)算細(xì)胞濃度：

此外還可使用細(xì)胞自動(dòng)計(jì)數(shù)器。

步驟4

用移液器將所需細(xì)胞量（合適的細(xì)胞數(shù)量）以所需分離率（此處為1:10）吸取至新的培養(yǎng)皿中，在各培養(yǎng)皿中加入所需容積的培養(yǎng)基（10ml）。注意細(xì)胞類型、細(xì)胞分離日期以及培養(yǎng)皿蓋子上的細(xì)胞傳代次數(shù)。將細(xì)胞放回37°C培養(yǎng)箱中。

將細(xì)胞放置一晚，讓其恢復(fù)和沉降。24小時(shí)后使用顯微鏡檢查細(xì)胞形狀、黏著性及是否存在污染。

細(xì)胞應(yīng)附著在培養(yǎng)皿底部并已開(kāi)始生長(zhǎng)和分裂。細(xì)胞應(yīng)附著在培養(yǎng)皿底部并已開(kāi)始生長(zhǎng)和分裂。讓細(xì)胞生長(zhǎng)直至匯合并準(zhǔn)備好進(jìn)入實(shí)驗(yàn)或開(kāi)始下一輪傳代培養(yǎng)。

參考文獻(xiàn)：

1.W. Ockenga, Phase Contrast: Making Unstained Phase Objects Visible, Science Lab (2011) Leica Microsystems.