如何提高超薄切片機的切片質量
并實現自動對齊功能
超薄切片技術是獲取樣品切片的zui常用方法。在室溫條件制備時，將樣品小塊嵌入環氧樹脂中，然后通過修剪去除多余的樹脂，并使用玻璃刀或金剛石刀將樣品切成厚度為50-100納米之間的薄片。
切片過程涉及多個手動制備步驟。在本應用說明中，我們將概述該過程，并解釋新的自動化解決方案，如何wanquan消除復雜的手動設置需求。
簡 介
透射電子顯微鏡（TEM）和掃描電子顯微鏡（SEM）等電子顯微鏡技術，廣泛應用于獲取生物或非生物材料樣品的結構信息。在電子顯微鏡（EM）應用中，較厚的樣品被切割成厚度小于100納米的超薄切片。
該樣品制備方法有助于獲取高分辨率的電子顯微鏡圖像，并且能夠進一步通過計算重建從多個連續切片中收集的信息，從而獲得較厚樣品的概覽（體積電子顯微鏡學）。
樣品塊的修整
為了獲得具有特定厚度的均勻切片，必須執行多個手動步驟，并具備相應的技能和專業知識。
粗 修
在切割感興趣區域之前，必須對樣品進行初步修整，以露出目標點，并去除過量的無樣品聚合物或非目標樣品區域。通常，修整的結果是形成（堆疊的）金字塔形狀，其尺寸逐漸減小（圖1）。
圖1：經過粗修和精修后的樣品塊。放大圖顯示了聚合物塊前端上的樣品面。聚合物塊前端面使用銑削裝置，以45°的形狀進行修整。使用超薄 切片機和具有45°邊緣的切片刀對塊面進行修整，形成金字塔形狀。
首先，粗修是通過手動使用刀片或使用EM RAPID來制備金字塔截體。EM RAPID的高速金剛石銑削頭，可以以特定角度朝向樣品，同時樣品在四輪中能夠進行90°旋轉（圖2）。
圖2：使用EM RAPID銑削裝置對樣品塊進行粗修。左：修整前的樣品塊。中：銑削第二個區域。右：最終粗修后的樣品。
精 修
接下來，將樣品塊安裝在超薄切片機上，并使用修塊刀減小樣品區域并塑造其形狀，以形成最終的切面。精修的目的是將樣品感興趣區域包含在小于1平方毫米的矩形或梯形區域內，并使上下邊緣與切片刀wanquan平行（圖3），這將在后續步驟中允許切片彼此粘附形成帶狀。帶狀切片可以整體收集，使用戶能夠按照切片的順序進行拍攝，這對于陣列斷層掃描應用尤其重要。
圖3：使用金剛石修塊刀進行精修。左：粗修后的樣品塊。中：精修前樣品塊的前端。下方可見一把45°金剛石修塊刀。右：樣品塊面的前端和右側已經進行了精修。
樣品與切片刀之間對齊
在對樣品塊進行修整以獲得平坦且暴露的塊面后，將其正確對齊到切片刀邊緣至關重要。最終目標是使樣品與切割平面之間的距離盡可能小，以避免樣品材料損失和切片不完整。
wanmei對齊樣品和切片刀是一項具有挑戰性的任務。它需要精密地手動調整樣品傾斜、旋轉和切片刀角度，同時需要正確地控制樣品進給（進刀）。
這對于新手或不常使用超薄切片機的用戶來說尤其困難。不僅存在損壞昂貴切片刀的風險，而且還可能損壞樣品，無法用于切片。即使經驗豐富的操作人員也需要小心謹慎，以確保在較薄樣品（如細胞單層）切片過程中，不會因初始位置未對齊，而損失太多材料。
方 法
為了判斷切片刀與樣品之間的距離，用戶需要使用底照光來觀察它們之間的間隙，整個過程在體視顯微鏡下進行。底照光從下方照亮切片刀的背面，并通過樣品塊面的光滑表面反射光線，呈現為一條明亮的條紋（圖4）。這被稱為“光隙"。
wanmei對齊表現為在整個塊面長度上均勻寬度的薄（藍色）光隙（見下文）。
圖4：切片刀背面在樣品塊面上的反射圖像。左：概覽圖，底照光被切片刀的背面反射至樣品塊面，幾乎照亮了整個前端面。右：用切片刀接近樣品時，塊面上的反射光變成小條紋，稱為光隙。光隙是指示切片刀與塊面之間方向的工具。
以下步驟通常以迭代順序執行，直到塊面和切片刀對齊為止。通常，兩者之間的距離可以小于500納米。
樣品旋轉
為確保切片能夠彼此粘附并形成帶狀，切片的上下邊緣必須wanquan平行。這只有在整個塊面與切片刀wanquan接觸時才能實現。因此，必須旋轉樣品以使其與切片刀邊緣平行（圖5）。
圖5：調整樣品旋轉。左：樣品旋轉與切片刀邊緣的示意圖。中：樣品未正確旋轉。右：樣品正確對齊到切片刀。
首先，將切片刀座移至足夠接近樣品的位置，以產生光隙。一旦在塊面上觀察到光隙，用戶需要調整樣品旋轉，使塊面下邊緣與切片刀平行。如果未調整切片刀角度，可能無法使樣品和切片刀平行，因為塊面尚未被修塊刀修整。
切片刀角度
為了補償塊面表面與切片刀之間的角度，需要旋轉切片刀，直到塊面的前導邊緣與切片刀平行（圖6）。這將確保樣品從左到右的整個區域與切片刀接觸，從而提供完整的切片，不會損失太多樣品材料。此外，上述操作確保樣品切割均勻，并使切片能夠彼此粘附，在切片刀水槽中形成條帶（圖6，下圖）。
圖6：調整切片刀角度。左上：切片刀和樣品塊面的示意圖。藍色切片刀以其邊緣與塊面平行的方式轉動。中上圖像：底照光照亮的塊面圖像。切片刀邊緣在圖像底部可見為黑色條紋。切片刀邊緣必須與塊面的下邊緣平行，但在這里并非如此。右上圖像：調整切片刀角度，使其與塊面邊緣平行。下圖像：切片在切片刀水槽中形成條帶。切片具有wanquan平行的邊緣，因此彼此粘附。
樣品傾轉
樣品傾轉是最關鍵但不易觀察的影響參數之一。如果樣品傾轉不正確，切片刀在切割過程中將不會與樣品運動保持一致。因此，在獲得完整切片之前，可能會丟失珍貴的樣品。
通過弧形樣品夾以調整塊面與切片刀邊緣之間的角度，可以調節樣品傾轉。以光隙為指標，用戶在調整過程中需要上下移動樣品，直到光隙在整個塊面上顯示相同的厚度（圖7）。
這需要通過迭代方法來調整樣品傾轉。在這個階段，切勿將切片刀太靠近樣品，否則塊面的離切片刀較近部分可能會被wanquan切掉，從而有損失整個樣品的風險。同時，也存在切片刀損壞的風險。
圖7：調整樣品傾轉。左：樣品傾轉原理的示意圖。樣品傾轉，直到塊面表面沿切割運動方向與切片刀邊緣對齊。中：上下移動樣品時的兩個光隙圖像。灰色條紋的厚度不同。右：調整后的光隙。
以光隙為作為調整的指標
樣品和切片刀角度調整的最后一步是使用光隙作為指標進行調整。在調整樣品傾轉之后，小心地將切片刀朝樣品推進，直到切片刀與塊面之間的光隙幾乎看不見。在接近過程中，光隙的顏色會發生變化，直到最終變為藍色（顏色的變化是衍射的結果，圖8）。使用這種方法，在整個塊面上對齊偏差能夠小于1µm。從塊面反射出的藍色光隙，通常表示塊面與切片刀之間的距離約為400納米。在此距離下，在所有角度上均勻分布的光隙是zui精確指標，盡可能減小材料的損失。
圖8：精細調整過程中，切片刀與塊面之間衍射產生的藍色光隙。
圖9：帶有電動切片刀架（1）和弧形樣品夾（2）的UC Enuity
內置的flexacam（i5或c5）相機，提供了切片刀和光隙的圖像，這些圖像會被分析，并將信息發送回來，以進行自動對齊工作（圖10）。
圖10：內置flexacam i5相機和觸摸屏截圖，顯示帶有自動對齊反饋線的圖像（也見下文）。
對齊過程會引導用戶完成接近階段，最終對齊步驟將自動完成。這種自動化設計旨在保護切片刀和塊面免受損壞，同時幫助用戶實現wanmei對齊。該功能幫助未經過培訓的用戶，如在核心設施或研究組內工作的用戶，在切片刀和樣品的初始定位階段，在不承擔損壞風險的情況下獲得高質量切片。
需要注意的是，要執行wanquan自動對齊功能，必須滿足某些先決條件。例如，塊面尺寸必須至少為250 x 250µm，最大為1200 x 1200µm。此外，塊面必須具有反射性且足夠干凈。
自動化工作流程
開始自動對齊程序前，首先應將切片刀接近塊面并居中。在用戶確認后，將執行自動對齊功能（圖11）。
圖11：UC Enuity顯示屏截圖，顯示檢測光隙步驟中的相關交互按鈕（左）。自動對齊過程中的相機圖像（右）。反饋線指示圖像中是否檢測到正確的邊緣。綠色：垂直中心線；洋紅色：光隙的上邊緣；白色：光隙的下邊緣（此處不可見，與紅線重合）；紅色：切片刀邊緣；藍色：自動檢測到的塊面左邊緣和右邊緣。
軟件檢測圖像中的不同邊緣，并對切片刀角度、樣品傾斜和樣品旋轉進行迭代對齊。在此過程中，樣品會上下搖動，以觀察分析整個塊面范圍的光隙，并據此調整樣品傾斜。
在過程結束時，可以自動將切片刀接近樣品，直到大約5µm的距離（圖12）。如果需要，也可以進行手動校正。
圖12：切片刀接近樣品，安全距離約為5µm。左：對齊后，用戶可以決定自動或手動接近樣品。右：接近后的光隙。將保持約5µm的安全距離。
多組測試結果
對齊過程的目的是避免在獲得完整切片之前，不必要地損失部分樣品區域。為了提供確鑿的證據，證明自動對齊功能能夠可靠地產生高質量切片，我們對樣品進行了一系列超薄切片測試。
在第一組代表性樣品中，專家手動進行了對齊。通常，專家需要切割5-10個厚度為100nm的部分切片，直到獲得完整切片。另一組樣品使用UC Enuity的自動對齊功能進行修塊，其中五個不同樣品使用不同設備進行修塊，樣品塊面尺寸不同。在兩組測試中，部分切片的平均數量均低于或等于10，而最少部分切片的數量在3到7之間（表2）。這證明使用UC Enuity可以成功實現自動對齊。
表2：使用UC Enuity自動對齊后獲得完整切片所需的部分切片數量。
測試1，n=4；測試2，n=2；測試3，n=4；測試4，n=7；測試5，n=2。
在超薄切片中，切片刀和樣品的對齊，對于實現高質量切片和減少獲得完整切片前的樣品材料損失至關重要。
由于對齊過程較為復雜，手動操作時需要用戶具備豐富經驗，因此UC Enuity提供的自動對齊解決方案，有助于減少非熟練和不常用戶對樣品或切片刀造成損壞的風險。UC Enuity還幫助他們實現wanmei的光隙調整，為高質量的切片提供了基礎。
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