要用顯微鏡在高倍鏡下檢查標(biāo)本，有許多因素需要考慮。其中包括分辨率、數(shù)值孔徑（NA）、物鏡的工作距離以及物鏡前透鏡采集圖像所用介質(zhì)的折射率。在這篇文章中，我們將簡(jiǎn)要地看一下如何在蓋玻片和物鏡前透鏡之間利用浸泡介質(zhì)幫助提高NA和分辨率。此外，我們還將考慮空氣和構(gòu)成載玻片、蓋玻片的玻璃的折射率，以及當(dāng)光從一種介質(zhì)傳播到另一種介質(zhì)時(shí)，如何使用浸沒(méi)介質(zhì)部分地減少錯(cuò)配。此外，文中還提供了使用油浸式物鏡的實(shí)用技巧以及水浸式物鏡的優(yōu)勢(shì)，特別是針對(duì)活細(xì)胞的成像。
光學(xué)顯微鏡所面臨的主要問(wèn)題之一是克服某些光學(xué)分辨率的限制并提高系統(tǒng)的NA值。簡(jiǎn)言之，物鏡的NA是指從標(biāo)本中收集光的能力，而分辨率是指物鏡分辨標(biāo)本中細(xì)節(jié)的能力。
分辨率和NA將在其他文章中詳細(xì)說(shuō)明，我們現(xiàn)在將介紹顯微鏡專(zhuān)家可用的浸沒(méi)技術(shù)，這種技術(shù)可在高倍放大率下對(duì)標(biāo)本進(jìn)行成像，同時(shí)克服分辨率的一些限制。
在物鏡前透鏡和標(biāo)本蓋玻片之間的空隙中填充浸沒(méi)液體可提高物鏡的分辨率。當(dāng)光從一種介質(zhì)傳遞到另一種介質(zhì)（例如，通過(guò)玻璃到空氣）時(shí)會(huì)發(fā)生折射 - 換句話(huà)說(shuō)，光會(huì)彎曲并散射。任何折射到空氣中的光線(xiàn)、被蓋玻片反射的光線(xiàn)或被物鏡前透鏡的金屬外殼實(shí)際阻擋的光線(xiàn)都不會(huì)對(duì)成像產(chǎn)生貢獻(xiàn)。浸沒(méi)液體的目的在于減少光在標(biāo)本上形成的折射和反射，并提升物鏡捕捉這些偏離光的能力（見(jiàn)圖1）。
圖1
光線(xiàn)穿過(guò)的介質(zhì)的物理性質(zhì)決定了光線(xiàn)被折射的程度。“折射率"是一個(gè)數(shù)值（沒(méi)有單位），該數(shù)值決定了光通過(guò)材料時(shí)的折射程度。空氣的折射率為1.0，而顯微鏡載玻片和蓋玻片的折射率通常為1.5。考慮到這一差異，浸泡液體的目的是匹配（盡可能接近）玻片的折射率，從而增加形成最終圖像的光線(xiàn)量。隨后，大多數(shù)浸油的折射率為1.51。常見(jiàn)折射率見(jiàn)表1。
浸沒(méi)介質(zhì) | RI |
空氣 | 1.00 |
水 | 1.33 |
甘油（100%） | 1.47 |
香柏油 | 1.51 |
徠卡浸沒(méi)油（標(biāo)準(zhǔn)和“F"型） | 1.51 |
玻片 | RI |
玻片（硼硅酸鹽或“Parex"） | 1.47 |
玻片（冕玻璃或鈉鈣硅玻璃） | 1.51 |
封片介質(zhì) | RI |
細(xì)胞培養(yǎng)基 | 1.31至1.33 |
Fluoromount-G™ | 1.4 |
ProLong®/ProLong® Gold | 1.46 |
VECTASHIELD® | 1.44 |
VECTASHIELD® Hard+Set™ | 1.46 |
Mowiol® | 1.41 – 1.49 |
理想情形是創(chuàng)建所謂的“均質(zhì)浸沒(méi)系統(tǒng)"。使用該系統(tǒng)可以獲得最大的分辨率和NA。均質(zhì)浸沒(méi)系統(tǒng)的目的是匹配（盡可能接近）物鏡前透鏡、浸沒(méi)介質(zhì)、蓋玻片/載玻片、封片劑和（原則上）聚光鏡透鏡的折射率和NA（見(jiàn)圖2和表1）。
通常不需要在聚光鏡的透鏡上使用浸沒(méi)液體。如果顯微鏡的設(shè)置和校準(zhǔn)正確，且在整個(gè)樣本上獲得最佳對(duì)比度和照明度（見(jiàn)“關(guān)于科勒照明"的文章），則聚光鏡將處于最適宜的位置和設(shè)置，從而有助于顯微鏡系統(tǒng)的整體NA。
圖2：標(biāo)本和物鏡前透鏡之間所有光學(xué)元件的折射率會(huì)給圖像質(zhì)量帶來(lái)很大影響。理想情況下，它們應(yīng)盡可能緊密地相互匹配，如本例中的標(biāo)本使用甘油基封片劑。
顯微鏡物鏡需要考慮的另一個(gè)因素是“工作距離"。這是當(dāng)樣本處于銳聚焦時(shí)，物鏡前透鏡和蓋玻片表面之間的實(shí)際距離（見(jiàn)圖3）。當(dāng)物鏡移到離載玻片更近的位置時(shí)，焦平面進(jìn)一步移向樣本中。然而，這在物理上受到限制，因?yàn)槲镧R只有在接觸到蓋玻片后才能移動(dòng)。工作距離與每個(gè)物鏡的放大倍數(shù)成反比關(guān)系。例如，10倍物鏡的工作距離可能為4 mm，而100倍油浸物鏡的工作距離通常為0.13 mm。相比之下，一些水浸/水澆蘸（Water Dipping）物鏡的工作距離約為3 mm。工作距離是另一條信息，通常刻在物鏡筒上，縮寫(xiě)為“WD"（不要與水鏡混淆-見(jiàn)下文）。
圖3
使用油浸物鏡時(shí)要記住的一個(gè)關(guān)鍵因素是使用正確匹配的浸油。只能使用物鏡制造商推薦的油。多年來(lái)，杉木油是常用于浸沒(méi)介質(zhì)（目前仍在市場(chǎng)上出售）。雖然這種油的折射率為1.516，但存在硬化趨勢(shì)，如果使用后不取出，可能會(huì)損壞透鏡。此外，這種油會(huì)吸收藍(lán)色波長(zhǎng)和紫外線(xiàn)，而且老化時(shí)會(huì)不斷變黃。
圖4
大多數(shù)現(xiàn)代化浸油都是人工合成并經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化處理，確保不會(huì)損壞透鏡或隨著老化而變色。要記住的一點(diǎn)是，浸油有一個(gè)最佳的工作溫度。大多數(shù)商用合成油的設(shè)計(jì)工作溫度為23℃，僅1℃的變化將導(dǎo)致折射率變化0.0004。其他浸油可在不同溫度下獲得最佳性能，但對(duì)于大多數(shù)用途，顯微鏡設(shè)備應(yīng)在23℃下保持穩(wěn)定（這對(duì)于共聚焦顯微鏡等儀器的維護(hù)也很重要）。
使用油浸式物鏡（見(jiàn)圖4）開(kāi)展熒光顯微鏡觀察時(shí)，建議使用特殊的低自體熒光油。很多通用浸油在特定情況下將會(huì)發(fā)出熒光。大多數(shù)用于熒光顯微鏡的浸油都通過(guò)名稱(chēng)/代碼之前或之后加上字母“F"來(lái)識(shí)別。
從使用低倍物鏡查看樣本開(kāi)始，在切片上找到感興趣的區(qū)域。
逐步切換至40倍放大率并將顯微鏡設(shè)置科勒照明。
通過(guò)物鏡轉(zhuǎn)盤(pán)（物鏡的連接底座）在40x和100x物鏡之間切換但不要直接接觸高倍物鏡。
從顯微鏡的一側(cè)看去，小心地將1滴浸油直接滴到蓋玻片上。將高倍物鏡擺入到位（繼續(xù)從一側(cè)觀察載物臺(tái)），先粗調(diào)然后微調(diào)對(duì)焦，讓物鏡前透鏡與浸油發(fā)生接觸。有些油浸物鏡的前透鏡是凹面的，這意味著還應(yīng)該在物鏡上滴一滴油以防止氣泡被困在凹透鏡中。
然后可以再次通過(guò)目鏡觀察。僅使用微調(diào)對(duì)焦來(lái)調(diào)整視野。雖然高倍物鏡含有彈簧加載式轉(zhuǎn)換器，但在這個(gè)階段粗聚焦很容易導(dǎo)致蓋玻片或載玻片破裂，也可能損壞物鏡前透鏡。
即便您計(jì)劃觀察其他載玻片，也應(yīng)在此階段清除物鏡上的浸油以防止可能污染顯微鏡的其他部分。對(duì)于不適合浸沒(méi)的顯微鏡部件和物鏡，浸油會(huì)滲透并造成損壞。用鏡片清潔紙巾在鏡片上擦一次，去除多余的油。每次擦拭都要用干凈的紙巾擦拭物鏡前透鏡，直到?jīng)]有殘留油的痕跡。可使用市售除油溶液或少量二甲苯最終清潔透鏡。同樣，在對(duì)透鏡應(yīng)用任何溶液之前，請(qǐng)務(wù)必仔細(xì)了解物鏡制造商的建議。
在研究級(jí)顯微鏡（通常是共聚焦顯微鏡）上有一種不太常見(jiàn)的浸沒(méi)式物鏡是“水浸"物鏡，通常在物鏡筒上縮寫(xiě)為“WI"或“W"。當(dāng)對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)基中的活細(xì)胞成像時(shí)，強(qiáng)烈建議使用水浸式物鏡。有兩種類(lèi)型的水浸式物鏡（見(jiàn)圖5）-“水浸"和“水澆蘸"（物鏡筒上通常縮寫(xiě)為“WD"，不要與“工作距離"混淆）。
圖5
水浸式物鏡通常與正置顯微鏡配置一起使用，用于直接浸入水或水基介質(zhì)/緩沖液中。水澆蘸物鏡則可提供很長(zhǎng)的工作距離。這種物鏡在生產(chǎn)時(shí)還配有十分曲折的彎角轉(zhuǎn)盤(pán)，使用惰性材料如陶瓷等制作而成。水浸物鏡的使用方式與油浸物鏡類(lèi)似，但要用水代替油。
使用水浸式物鏡的優(yōu)點(diǎn)之一是簡(jiǎn)單地將水作為浸沒(méi)介質(zhì)。很明顯，這種介質(zhì)很容易清洗。此外，您不需要根據(jù)正在進(jìn)行的成像使用特定的浸沒(méi)油，也不需要使用顯微鏡和物鏡制造商zhiding的浸沒(méi)介質(zhì)。但使用水浸式物鏡時(shí)有一些缺點(diǎn)。與水性物鏡相比，油浸物鏡具有更高的分辨率。此外，由于水的粘度（與油相比），使用水浸式物鏡容易受到振動(dòng)和小空氣運(yùn)動(dòng)的影響。這種問(wèn)題可以通過(guò)確保顯微鏡放置在防振臺(tái)上來(lái)克服。或者，更簡(jiǎn)單的解決方案是在切片上放置一個(gè)特殊的環(huán)來(lái)形成一個(gè)小水池。水浸式物鏡的最后一個(gè)缺點(diǎn)是成本。一些水浸式物鏡的成本相當(dāng)于一套完整的研究級(jí)顯微鏡。
徠卡提供的水浸顯微鏡自動(dòng)加水裝置克服了長(zhǎng)時(shí)間活細(xì)胞成像或篩查實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)水蒸發(fā)的潛在問(wèn)題（見(jiàn)圖6）。
圖6：水浸顯微鏡自動(dòng)加水裝置在實(shí)驗(yàn)運(yùn)行中自動(dòng)添加浸沒(méi)用水。
活細(xì)胞通常置于細(xì)胞間室并且會(huì)被細(xì)胞培養(yǎng)基（或緩沖液）所覆蓋。間室（和培養(yǎng)基）有助于確保細(xì)胞或組織在成像的同時(shí)處于穩(wěn)定的環(huán)境內(nèi)。因此，到小室蓋片的最佳焦距將變得比較大，這使得工作距離較短的油浸式物鏡不適合通過(guò)蓋玻片/間室、培養(yǎng)基/緩沖液對(duì)細(xì)胞/組織成像。
此外，使用油浸式物鏡來(lái)觀察水性培養(yǎng)基內(nèi)的細(xì)胞時(shí)還會(huì)增加額外的折射問(wèn)題，因?yàn)橛秃退恼凵渎什煌?/p>
觀察間室內(nèi)的活細(xì)胞時(shí)，光路將遇到不同的折射率。間室/蓋玻片的材料和覆蓋細(xì)胞或組織的水性培養(yǎng)基之間存在不同的折射率。從標(biāo)本圖像中傳出的光將在每個(gè)階段發(fā)生折射而導(dǎo)致球面像差。
圖7：可以調(diào)節(jié)物鏡的校正環(huán)以適配不同厚度的蓋玻片。電動(dòng)校正環(huán)可優(yōu)化設(shè)置，把干擾降低到最小。
最后，水浸式物鏡最為適合的應(yīng)用之一是活細(xì)胞的共聚焦成像，因此水浸式物鏡通常是許多共焦系統(tǒng)的標(biāo)配。由于水與油相比粘度較低，使用這些物鏡可降低對(duì)蓋玻片的表面張力，這意味著標(biāo)本發(fā)生移位的可能性較小，尤其是在采集Z軸疊加的過(guò)程中。
圖8：對(duì)于使用折射率接近于甘油/水混合物的封片劑（如VECTASHIELD® Hard+SetTM）樣本，甘油物鏡是較佳選擇。
甘油是另一種浸沒(méi)介質(zhì)。很多固定樣本都使用Mowiol、Vectashield或類(lèi)似的甘油基封片劑封片（見(jiàn)表1）。這些介質(zhì)的折射率接近于80/20 甘油/水混合溶液的折射率（RI=1.45）。對(duì)于此類(lèi)封片劑封片標(biāo)本，甘油物鏡（見(jiàn)圖8）是zuijia選擇。
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