熒光壽命成像（FLIM）與Förster共振能量轉移（FRET）相結合，已被證明非常有利于生物醫學研究中各種結構和細胞動態變化的研究。因為FRET信號強烈依賴于FRET配體和受體的距離，所以FRET允許監測分子相互作用。這允許研究分子的相互作用，如配體-受體復合物，蛋白質-蛋白質相互作用、效應蛋白與DNA的相互作用等。
另一方面，隨著對FRET理解的深入，科學家已經可以設計FRET探針，以便獲得可控的供體-受體結合、釋放效率。對于FRET探針，我們可以分為兩種類型的分子相互作用：探針內的FRET供受體和探針與配體的相互作用。
今天小編將詳細介紹什么是FLIM和FRET，以及FLIM-FRET的結合帶來的幾個應用實例。
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目前，大多數生物探針都是基于熒光。熒光探針亮度的增加或減少取決于其濃度。但是，熒光強度不僅受研究對象濃度的影響，還受照明強度、光漂白以及基質吸收和陰影效應等。為了盡量避免這些問題，科學家傾向于優先選擇比率染料（ratio-dyes），因為其允許對背景的干擾進行校準。盡管如此，基于熒光強度的測量并不是非常可靠，因為即使采用精心設計的校準方法，重復性也還是不夠理想。
FLIM提供了更好的方法，因為熒光壽命與染料濃度、照射強度以及熒光信號在樣品中的吸收和散射無關，因此對分子間相互作用不會產生影響。另一方面，熒光壽命受環境的影響顯著，這使得FLIM可用于測量環境參數的影響：在一些特殊的分子環境情況下，存在第二種染料，其可以吸收種染料發射的能量——FRET。該過程為壽命測量提供了一種靈敏的方法。對于這種組合技術，越來越多的探針被開發出來，并用于生物醫學研究：FLIM-FRET生物傳感器。
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什么是FLIM？
熒光的激發發生在具有適當光子能量（激發光）的情況下。吸收光子后（藍色箭頭，圖1a），分子內的原子釋放少量熱量（虛線圖1a）。因此，與激發光相比，發射光具有更長的波長（圖1b）。此外，能量釋放還可以通過與低能光子的相互作用來觸發（圖1c），此種情況被稱為受激發射，是STED超高分辨顯微鏡的基本原理。后，能量也可以*釋放而不發射光子，從而降低熒光效率（猝滅，圖1d）。
圖1. 熒光中的光量子變化：（a）吸收，藍色；（b）發射，綠色；（c）受激發射，紅色；（d）猝滅。涉及光子的過程以實線箭頭表示，并帶有相應的顏色。非輻射情況以黑色虛線表示。G：基態。E：激發態。
熒光圖像通常被認為是發射光的二維強度分布。可測量的強度是激發波長或發射波長或兩者的函數。通過對一系列連續或不連續光譜獨立或同時檢測來測量發射信號。終結果用于構建彩色圖像、分離信號通道、分辨空間和時間中目標的相互作用等。然而，熒光過程也提供了額外的信息維度：與強度無關的熒光壽命。熒光壽命可用于在受控條件下識別和分離熒光物質，并揭示分子環境的細節。
熒光激發后，熒光分子會在激發態停留一段時間，然后衰變回基態。它們處于激發態的時間是不可預測的，因為它是量子力學控制的隨機過程。這種過程的一個*的例子是不穩定原子核的放射性衰變，而每種核素的半衰期都是非常特殊的。對于熒光，處于激發狀態的時間τ即為熒光壽命。除了強度特征之外，熒光壽命的特殊性使其成為區分熒光染料的行之有效的方法。
a
b
c
圖2. 用激光脈沖激發后分子發射光子（紅色箭頭）的到達時間t?的測量值（藍色箭頭）。上圖a中繪制了5個測量值。b：到達時間的直方圖，包括來自a中的五個激發。重要的是＃軸，時間非常短。指數衰減曲線（紅色）擬合直方圖。c：擬合顯示，例如，兩個單衰變（藍色和綠色曲線），衰減時間τ1和τ2以及振幅A1和A2。這些的總和等于紅色衰減曲線。
因此，FLIM圖像不代表每個像素的強度，而是提供像素位點的壽命信息[1]。經典的FLIM測量方法（時間相關單光子計數，TCSPC）確實測量單個位點的熒光壽命事件。像素信息是“平均到達時間”，即在該像素中測量的所有壽命事件的平均值，或者是直方圖中對到達時間進行曲線擬合提取的一個或多個特征時間（圖4）。為了獲得顯著結果，每個像素應該測量大約400個TCSPC。因此，我們經常聽到的有關熒光壽命測量的抱怨：“壽命分析太復雜了！”。
圖3. 小鼠胚胎的全身FLIM圖像。722個視野拼接。SP8 FALCON采集時間約1小時（傳統TCSPC方法，約1天）
什么是FRET？
Förster共振能量轉移（FRET）是一種影響熒光測量的淬滅現象。上文已經介紹，除了發射光子，分子還可以釋放全部激發能量而不產生輻射（淬滅，圖1d）。如果猝滅分子也是熒光染料，則能量可以通過共振轉移到受體（A）從而供體（D）沒有發生光子輻射（圖3）。因此，釋放的能量不會作為熱量消散，而是存儲在受體熒光染料的激發態[2]。對于FRET的發生條件，受體的激發光譜必須與供體的發射光譜重疊，并且兩個分子也必須緊密接觸和排列位置適當。在這種情況下，“緊密接觸”意味著距離不應超過大約10納米。分子越近，FRET發生的概率就越高。
FRET模型
距離和轉移速率kF之間的關系：
其中R0表示“Förster半徑”，它是轉移效率為50％的供受體間的距離。Förster半徑假定為每個供體-受體對的特定值。供體激發的特性壽命用τD表示，r為兩種分子之間的實際距離。由于轉移速率與r6成反比，因此FRET僅在供體和受體緊密接觸時發生。由于這種關系是*的，因此，初FRET僅用于估計分子距離（“分子標尺”）。此外，的FRET效率還取決于供體發射和受體激發的重疊程度以及兩種熒光染料的能量轉移方向。
圖4. 普通熒光和FRET：a）熒光供體分子D可以吸收光子（藍色）并發射能量較少的光子（綠色）。或者b），能量可以以非輻射地形式（黑色虛線）傳遞到相鄰的受體熒光染料A，其吸收帶寬具有與D的發射帶寬重疊的區域。與D的發射相比，受體發射的光子（紅色）能量更低。從D到A的非輻射轉移稱為“Förster共振能量轉移”即FRET。 c）FRET的 Jablonski圖。
整個過程：供體D被短波長光子Ex激發，能量以非輻射方式（FRET）傳遞給受體A，受體發射長波長光子Em。
下面兩個現象的發生可以辨別FRET的發生。
首先，樣品（受體）發出的熒光顏色不同于獨立供體受激發而發射的顏色。對于圖3中的示例，在藍色激發之后供體不應發射紅色光。可以測量該發射并與供體發射進行比較的方法稱為“sensitized emission”。 Sensitized emission可量化FRET的發生。這種測量可以在活體樣本中進行，但是如果以熒光強度進行測量則需要復雜的校正，因此可以用于各種誤差校準。同樣，壽命測量也是可選擇的方法。FRET對壽命的影響將在本文后一節中介紹。
其次，供體發射減少，因為一些供體激發將變為受體激發。這種現象可以用于“受體光漂白”的測量，即在通過光漂白*受體時測量供體發射的變化。去掉受體后，供體發射將增加。該方法僅適用于固定樣品。
FLIM-FRET生物傳感器
用生物方法進行的標記可以統稱為“生物傳感器”，可以是蛋白質或肽、DNA或RNA的片段、細胞等，甚至整個生物體也可以作為生物傳感器，例如檢測污染水毒性的死亡率篩選實驗中的淡水魚。在更大概念下，生物傳感器還可以包括含有生物學部分和光電學的用于測量分析物濃度的復合傳感器。*的是，例如，葡萄糖生物傳感器——糖尿病患者用于控制血糖的快速且簡單的裝置。FLIM-FRET生物傳感器通常表示使用熒光（壽命）作為信號并且發生FRET的熒光現象。
到目前為止，我們已經了解FLIM-FRET生物傳感器的工作原理。
部分是探針：通常是與分析物（目標分子）相互作用的蛋白質或肽。蛋白質和肽可以方便地通過基因工程方法引入到靶標內，因此是優選的傳感分子。的例子是鈣調蛋白。鈣調蛋白可結合Ca2+離子并在結合或解除結合時發生構象變化。
第二部分涉及熒光。我們需要用一對可以進行能量轉移的熒光染料標記的分子。熒光染料分子必須以一定的方式連接到探針上，即在一種構象狀態下它們相距很遠并且不能進行能量轉移，但在替代構象狀態下它們相距很近、且排列位置適當，并且觸發后能進行能量轉移。當探針結合或釋放被分析物時，FRET會發生或消失。我們可以通過Sensitized emission來測量結合或釋放的程度。如果使用熒光蛋白作為熒光染料，則整個生物傳感器可以在遺傳上表達，并可以被引入任何生物靶標中，甚至是特定的亞細胞結構。適合的供受體對如：作為供體的CFP（青色熒光蛋白）和作為受體的YFP（黃色熒光蛋白）。
第三部分是壽命測量。如上所述，通過強度進行的Sensitized emission測量容易出現明顯的誤差，并且需要麻煩的校準和復雜的校正（主要是因為強度受許多其他因素的影響，不僅僅是那些對FRET過程有影響的因素）。壽命基本上僅取決于熒光染料種類和所處環境的影響。在FRET的情況下，與純熒光發射相比，熒光壽命將會縮短。在圖4中，使用蓄水池（類似于激發態存儲的能量）排水來解釋壽命縮短的原因。如果供體只能發出熒光（綠色），那么相當于只有一個排水管控制排空蓄水池的速度（a）。如果供體可以將能量轉移到受體，則猶如在蓄水池中打開第二個排水管（紅色），結果是水將更快地被排空（b）。
圖4. a）：在沒有FRET的情況下，供體分子的激發態能量庫D 僅通過發射光子來釋放能量。因此，激發態的能量僅被一個控制激發態的壽命的漏極（綠色液滴）決定；b）：如果受體分子可以從供體分子吸收激發能量，則存在第二個排出通道用于排空激發態能量庫。因此，耗盡更快，因此，在發生FRET的情況下，壽命更短。
這種壽命差異用于檢測特定分析物（分子內FRET）結合后傳感器分子的構象變化。當然，可以以相同的方式研究用適合的FRET供受體中兩個分子之間的任何相互作用。
因此，如果我們測量供體的壽命變化，就可以監測整個傳感器的構象轉換，并由此監測分析物濃度的變化。如果結合的構象導致較低FRET的發生，則供體壽命將相對于分析物濃度增加，反之亦然。
為了以足夠的精度和速度測量體內動態變化的熒光壽命，儀器需要高靈敏度，兼具快速幀頻、以及時間相關單光子計數區分的適當方法[3]。
FLIM-FRET的應用示例
為了說明FLIM-FRET在現代生物醫學科學中的作用，小編在此舉下面兩個例子。
FLIM-FRET應用不僅涵蓋用于分析物檢測的生物傳感器，還涵蓋蛋白質、肽、核酸等的各種相互作用。典型地應用如熒光蛋白CFP和YFP或衍生物的使用。為了更好的解釋原理，圖5以綠色和紅色顯示熒光的釋放。
一
細胞Ca2+研究
Ca2+離子在細胞生理學中具有許多重要作用，例如，作為細胞信號傳導中的第二信使。它是肌肉收縮的必需成分，能夠釋放神經遞質，并有助于活細胞的膜電位穩定。它也是許多酶反應和血液凝固的重要因子。
為了研究這些功能，有必要使用在活細胞內快速且代謝的探針。標準FLIM-FRET生物傳感器實例之一是Ca2+指示劑“cameleon”（請參考本文引用文獻）。有各種各樣的cameleons，其名稱表示對Ca2+敏感性及其顏色變化，如chameleon [4]。
Cameleon探針中的傳感器是鈣調蛋白。它在與鈣結合后會發生構象變化。具有兩個熒光蛋白，例如CFP和YFP，形成FRET-biosensor（圖5）。
圖5. 左：沒有Ca2+的傳感器上的兩個熒光蛋白相距較遠，沒有發生FRET，熒光壽命很長。右：在Ca2+結合后，構建體發生構象變化，兩個熒光蛋白緊密接觸并發生FRET。供體的壽命變短，這是用于監測Ca2+水平的信號。
Cameleon鈣傳感器在Ca2+離子結合時顯示FRET，即在鈣存在的情況下壽命將縮短。
二
細胞cAMP研究
細胞信號傳導中同樣的第二信使是cAMP，它被發現是盤基網柄菌子實體發育過程中的形狀調控因子[5]。cAMP是激素的細胞內信使，不通過細胞膜轉移，因此在碳水化合物循環和脂質代謝中起關鍵作用。它還涉及一些離子通道的調節。
與cameleon類似，通過將cAMP結合蛋白Epac與兩種熒光蛋白融合，可以構建生物傳感器[6] [7]。
圖6a. 左：沒有cAMP的Epac分子。熒光蛋白與FRET緊密接觸，壽命短。右：在結合cAMP后，構建體發生構象變化，使熒光蛋白進一步遠離減少FRET的發生。壽命變長。該變化用作監測cAMP活動的信號。
圖6b. uncaged cAMP刺激培養中的細胞并用Epac FRET- Biosensor 作為探針、SP8 FALCON進行快速壽命成像。對紅色圓圈區域進行壽命分析信號（平均到達時間t?）。曲線圖顯示了t?隨時間的變化。友情提供：K. Jalink，Bram van den Broek，荷蘭阿姆斯特丹NKI。
FLIM-FRET還可用于近些年多種熱門研究中，如非干擾性繪制細胞球3D培養中代謝狀態的空間和時間變化[8]，FRET-Biosensor（T2AMPKAR）用于監測腫瘤球體中AMPK（5'腺苷-磷酸激活的蛋白激酶）的活性。為了充分成像球狀體的3D結構，可以使用LEICA TCS SP8 DIVE多光子系統進行激發。
這些例子只是生物醫學研究中FLIM-FRET應用的一小部分。蛋白質、供體與受體、DNA與蛋白質或DNA 的片段與RNA的相互作用都可用熒光壽命結合熒光供振能量轉移的方法進行研究。因此，FLIM和FRET領域中的研究成果將在不久的將來顯著增加！
參考
1.Gerritsen et al: Fluorescence Lifetime Imaging in Scanning Microscopy. Pawley J (Ed) Handbook of Biological Confocal Microscopy, 3rd ed. Springer New York (2006)
2.Förster T: Energiewanderung und Fluoreszenz. Die Naturwissenschaften. 6, pp166-175 (1946)
3.Borlinghaus RT: Lifetime - a Proper Alternative. Leica Science Lab (2018)
4.Miyawaki A et al: Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature 388, pp882-887 (1997)
5.Konijn TM et al: The Acrasin Activity of Adenosine-3’-5’-cyclic Phosphate. PNAS 58, pp1152-1154 (1967)
6.Ponsioen B et al: Detecting cAMP-induced Epac activation by fluorescence resonance energy transfer: Epac as a novel cAMP indicator. EMBO reports 5/12, pp1176-1180 (2004)
7.Klarenbeek J et al: Fourth-Generation Epac-Based FRET Sensors for cAMP Feature Exceptional Brightness, Photostability and Dynamic Range: Characterization of Dedicated Sensors for FLIM, for Ratiometry and with High Affinity. PLoS One, 10/4 (2015)
8.Chennell G et al: Imaging of Metabolic Status in 3D Cultures with an Improved AMPK FRET Biosensor for FLIM. Sensors (Basel), 16/8: 1312 (2016).
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