本篇繼上一篇“實用建議：“如何合理設計穩定的凍干蛋白配方（一）"繼續為大家分享蛋白樣品凍干的理想賦形劑有哪些、基于成功蛋白凍干配方會導致Final失敗的一些細節問題等。

》》》對于蛋白樣品，理想的賦形劑有哪些？

從凍干對蛋白的所有危險以及我們需要在各個環節考慮的所有因素來看，快速開發一個穩定的蛋白配方看起來似乎是不可能的。幸運的是，如果我們能夠采用合理的方法對配方進行很好的設計，大多數的配方問題是可以得到快速解決。

這里，我們主要是對初始配方成分的選擇提供基礎。在一些情況下，初始的配方很有可能就是走向市場的Final產品。給定的組分，進行不同微小的修改，已經被成功地用于蛋白藥物。需要強調的是對于凍干配方，在能夠提供良好穩定性和結構的情況下，成分越簡單越好。所加入的賦形劑都須要有數據證明對配方起有益的作用。

01給定蛋白質維持穩定性的具體條件

對于一些通用型的穩定劑，可以有效地保護絕大多數的蛋白質，在選擇這些穩定劑之前，我們有必要通過優化影響蛋白物理和化學穩定性的具體因素來選擇合適的穩定劑。

影響蛋白物理和化學穩定性的具體因素：

1. 避免偏激的pH值可以顯著降低蛋白脫氨基的幾率。而且，通過優化溶液的pH值，可以顯著提高蛋白在凍干過程中抵抗去折疊的能力。

2. 還應該研究其他能提高蛋白質穩定性的特異性配體（通過增加去折疊的自由能）。肝素和其他聚陰離子對生長因子的穩定性影響就是一個很好的例子。

3. 其它需要考慮的重要因素是離子強度對蛋白的去折疊和聚合的影響。須意識到，在預凍過程中，由于冰的形成將溶液濃縮，離子強度可增加50倍。因此負責原料藥純化和做藥物配方前研究的人員已經對這些問題有了深刻的認識，配方科學家應該在著手設計凍干配方之前與他們進行溝通。

即使在針對蛋白質穩定性優化的特定的溶液條件下，但是如果樣品需要幸免于凍干的損害并長期保存，有必要加入一些其它的保護劑。首先，我們考慮一些已經用在凍干蛋白配方中的成分，但它們不能提供蛋白的穩定性，而且可能會促進蛋白在儲存期間的破壞。我們將提供一個簡單、有效的思路，并且討論選擇這些成分的原理。

02不能提供蛋白穩定性的賦形劑

部分多聚物作為賦形劑的優缺點

在凍干工藝的快速開發過程中，為了獲得一個強壯的蛋糕結構，一些多聚物，如葡聚糖，氨基乙基乙醇胺淀粉，因具有較高的塌陷溫度，導致Final產品的Tg也會比較高，常常是受歡迎的賦形劑。

不好的是，這些多聚物在凍干過程中不能抑制蛋白結構的去折疊，因此在后續的儲存中不能提供穩定性。無法抑制凍干誘導變性的原因大概是聚合物過大而無法與蛋白質氫鍵合，無法代替脫水過程中損失的水，或者是因為聚合物與蛋白質形成了分離的無定形相。盡管當這些多聚物單獨使用時不是一種很好的穩定劑，但是經證實，如果其結合雙糖穩定劑可以具有較好好的作用。

凍干過程中的有效穩定劑

對大量的化合物進行測定，顯示在凍干過程在較有效的穩定劑是雙糖，但是避免使用還原性糖。還原性糖在凍干過程中可以有效抑制蛋白結構的去折疊，但是在干燥樣品的儲存過程中，可以通過美拉德反應（糖的羰基和蛋白質上的游離氨基）降解蛋白，結果形成含有降解蛋白的棕色糖漿，而不是含活性蛋白的白色蛋糕狀結構。通常，我們減緩這個過程的方法是將樣品儲存在零度以下，這就失去了產品凍干的意義，這些還原性的糖包括：葡萄糖，乳糖，麥芽糖，麥芽糊精等。

在早期的研究中，晶體類的填充劑如甘露醇，甘氨酸在凍干過程中不能提供蛋白很好的穩定性，但是，一些配方使用了這兩種物質的混合物，并且成功地推向了市場。在這些案例中，甘露醇和甘氨酸適當的比例可以導致一大部分的化合物保持無定形狀態。這部分無定形狀態的化合物足以抑制凍干過程中蛋白的去折疊并且提供長期儲存的穩定性。但是建議謹慎選擇這種方法，因為達到合適的工藝條件再加上合適的賦形劑比例，既耗時又很難辦到的。

03賦形劑的合理選擇

如何合理的選擇賦形劑？

案例分享

舉個具體的案例說明，假設：

1. 蛋白藥物的濃度定在2mg/ml；

2. 主要的降解途徑是凍干后或復水后蛋白的聚合以及儲存期間蛋白的脫氨基；

3. 優化具體的條件（如用檸檬酸鹽緩沖液控制pH為6）只能將凍干和復水后聚合程度降到10%，盡管樣品在低于Tg溫度的20℃下進行儲存脫氨基速度仍然不能接受。加入晶體類的膨脹劑，如甘露醇，保持樣品強壯的結構及良好的外觀。

在這種情況下，主要缺少的成分是非還原性雙糖，其在干燥樣品中會與蛋白形成無定形的結構，作為主要的穩定劑，主要選擇蔗糖或海藻糖。它們在預凍階段能夠很有效地保護蛋白并且能夠很好的抑制復水過程中蛋白結構的去折疊。預凍階段的保護取決于初始糖的總濃度，有時，超過5%（w/t）的濃度可以盡可能大程度地保持蛋白的穩定性。相反，在干燥階段，蛋白的保護取決于Final糖和蛋白的質量比。一般來說，糖和蛋白的重量比至少為1:1時，可以提供較好的穩定性，當達到5:1時，可以達到很佳的穩定性。保持蛋白的濃度不變，選取一定范圍的糖濃度進行篩選和檢測，通過干燥樣品中天然結構保留率以及復水后蛋白聚合降低的程度來確定最合適的濃度。

一般來說，合適的糖濃度，可以在凍干過程中提供蛋白很好的穩定性，并且如果Final樣品的Tg高于儲存溫度，在后期的儲存期間也可以提供蛋白較好的穩定性。例如，假定最高的儲存溫度為30℃，那么Final產品的Tg ＞50℃應該是穩定的，但前提是Final樣品的含水量需要達到允許的水平，因為水分的存在會降低樣品的Tg。可以使用DSC檢測每種樣品的Tg值。

蔗糖/海藻糖如何選擇？

蔗糖和海藻糖，作為兩種常用的穩定劑，均有其優勢和劣勢，可根據不同的情況進行選擇：

● 在任何水分含量的樣品中，海藻糖均會有較高的Tg，因此較為容易凍干。另外Tg ＞50℃的條件可以允許樣品有較高的殘留水分。然而，技術工程師應該能夠針對這兩種雙糖設計經濟有效的工藝。如果樣品中蛋白濃度較高，可以提高Tg，這樣就會弱化海藻糖的作用；

● 與蔗糖相比，海藻糖更能抵抗酸解，雙糖水解后會產生還原性的單糖，這是需要避免的。通常情況下，如果pH不是很低，如pH4左右或更低，這個應該不是很大的問題；

● 蔗糖在凍干過程中抑制蛋白去折疊方面看似比海藻糖更有優勢，當蛋白在預凍階段非常不穩定（需要較高的糖濃度）和/或蛋白濃度較高時，這種優勢更明顯。海藻糖的相對不穩定性是由于在預凍和干燥過程中其更易于與蛋白之間產生相分離。對于給定的配方，這是否會有問題不能被預測，因此，每種制劑配方都需要檢查其保護蛋白的能力。

表面活性劑的作用

在這里，我們案例中的配方可能就比較完整了，就像許多蛋白質的情況一樣。然而，我們假設，即使蔗糖全部抑制可檢測的蛋白質去折疊，正如用紅外光譜對干燥固體的結構分析所評估那樣，在復水后，仍然有1%的聚合蛋白。因為在原始的樣品中是沒有任何聚合的，假設在凍干過程中，一小部分蛋白發生了去折疊，在復水后，部分這些分子又重新折疊，但是部分聚合在一起。這個實際上看起來是個很普遍的問題，就像在凍干之前一些處理造成的聚合。幸運的是，通過在配方中加入一些非離子型表面活性劑，如聚山梨醇酯（吐溫）通常可以抑制蛋白的聚合。要求的濃度通常比較低（＜0.5% w/v），通過將表面活性劑滴定到包含所有其它組分的凍干制劑中，可以識別出理想濃度。應避免加入過量，因為表面活性劑在室溫下是液體的狀態，如果濃度較高，會降低配方的玻璃態轉變溫度。然而，通常在優化蛋白質穩定性所需的非常低的濃度下，不會有問題。

表面活性劑看作是畫龍點睛，通常在凍干產品配方中加入表面活性劑是有利的，可以抑制處理過程中界面引起的去折疊和聚集（如起泡夾帶或瓶-液界面引起的）。

最重要的是表面活性劑在凍干/復水過程中抑制聚合的能力，目前還不太清楚表面活性劑的保護在哪一步起作用的。有資料證明，表面活性劑在凍融及復水過程中可減少蛋白聚合并且在預凍階段有助于抑制蛋白的去折疊，對干燥固體中聚集物特定紅外波段的檢查表明，表面活性劑可以抑制凍干過程中產生的聚集。在復水過程中，曲折疊分子的聚合能通過表面活性劑得到抑制，猜測是通過分子之間的相互作用和/或作為一種潤濕劑，加速凍干產品的溶解。如果顯示表面活性劑在復水過程中是有益的，則可以通過在稀釋劑中加入表面活性劑來達到這種效果。

》》》還有哪些意想不到的危險可能會導致失敗？

盡管根據上述給出的建議，對于給定蛋白，我們可以設計出成功的配方，但是，還有其他一些問題可能會導致Final失敗，特別是在長期儲存期間。

● 賦形劑中經常會有一些污染物，這些會導致蛋白快速的化學降解，糖類和甘露醇中會含有過渡金屬元素，表面活性劑可能被過氧化物污染，所有的這些可以促進蛋白的氧化；

● 在儲存過程中，水分從膠塞轉移到產品，引起水分參與的降解，直接損壞蛋白，并且降低蛋白的Tg,加速蛋白的降解，特別是當儲存溫度高于Tg 時；

● 即使在高溫（如40℃）下的儲存穩定性研究中，一切都表現出理想的狀態，但有一個常見的，但很少報道的事件可能是災難性的，這個問題可以用下面的故事來說明。產品在實驗室中在40℃下儲存可以保持幾個月的穩定性，在冬季，產品在運輸過程中也保持良好的穩定性，沒有來自消費者的問題報告，然而，有時在夏季，運輸后，在室溫下儲存僅2周后發現產品過度降解，用差示掃描量熱儀DSC對一開始的干燥粉末進行了檢查，給出了合理的解釋，結果發現，制劑中的甘露醇沒有全部結晶，而是形成了Tg約為45℃的亞穩玻璃態，當在夏季運輸過程中，超過了這個溫度時，甘露醇變發生結晶，最先與甘露醇結合的水被轉移到了剩余的無定形相中，蛋白相的水含量增加，降低了它的玻璃化轉變溫度，因此，加速了蛋白質的降解。這個問題可以使用DSC設計合理的退火方案使甘露醇再預凍階段全部結晶來避免，另外也可以通過調整甘露醇的濃度，降低殘留水分含量，使甘露醇即使在45℃的條件下也不會結晶。

》》》對于給定的蛋白藥物，這些信息足夠嗎？

對于大多數的蛋白，上面給出的建議一般會設計出成功的配方，但是，每種蛋白都有其自有的的物理化學特性和穩定性要求。因此，針對每種不同的蛋白，配方也需要自定義設計。結合蛋白本身的特性知識以及選擇合理的賦形劑可以快速設計出穩定的凍干蛋白配方。

最后，在快速凍干工藝中保持干物質的物理性質和在干燥后獲得天然的蛋白質之間需要折衷，研究表明：當蔗糖結合葡聚糖一起使用時，由于蔗糖的作用，蛋白質的天然結構可以保留在干燥的固體中；葡聚糖的存在提高了制劑的Tg，并提供了一種無定形的填充劑，快速干燥的同時保留了所需的蛋糕性質；其他的一些聚合物有可能提供與葡聚糖相同的優勢，如氨基乙基乙醇胺淀粉也具有較高的Tg，通常比葡聚糖更容易接受用于腸胃外給藥。期望可以合理地利用這些多聚物作為Tg的調節劑，使得制劑更穩定，更容易快速凍干。

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譯自：《Rational Design of Stable Lyophilized Protein Formulations:Some Practical Advice》  John F.Carpenter,Michael J.Pikal,Byeong S.Chang,Theodore W.RandolpH pHarmaceutical Research, Vol.14,No.8,1997

* 如有理解錯誤之處，還請參考原文

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