之前我們在《干貨分享 | 凍干樣品配方的關鍵溫度的測量》中，就已經聊到過關鍵溫度對于凍干工藝的重要性。

在冷凍干燥過程中，產品應保持在其關鍵溫度以下，如玻璃化轉變溫度(Tg’），共晶點(Teu)和塌陷溫度(Tc)，以確保一個安全和穩健的循環，并減少產品冷凍干燥后出現的有害缺陷的風險。缺陷可能包括但不限于產品內的物理塌陷或微塌陷、活性喪失和高水分含量。

微塌陷程度是具挑戰性的量化缺陷之一，許多配方由于藥物活性喪失而在第一個周期失效。

一、如何量化微塌陷程度？

MicroPress 微壓力凍干餅分析儀

MicroPress 微壓力凍干餅分析儀是一款由Biopharma公司*開發的創新儀器，用于量化低密度材料中的原位微觀缺陷，特別是在所有凍干產品中。

例如，甘露醇經常用于配方中，它具有較高的關鍵溫度，可以掩蓋具有明顯較低關鍵溫度的產品的塌陷。葡萄糖的關鍵溫度在-41℃左右，當與甘露醇結合時，如果干燥超過關鍵溫度，就會塌陷。

然而，由于甘露醇的膨脹性，該混合物盡管可能存在結構缺陷，但一旦冷凍干燥，就具有良好的外觀。在保持甘露醇濃度不變的同時，可以通過改變葡萄糖的濃度來確定微塌陷的程度和餅狀結構的影響。通常， 由于高溫，用來冷凍干燥這種溶液的循環不會使葡萄糖足夠冷凍干燥，因此可能會發生塌陷。相反，甘露醇會干燥足夠的量來保持蛋糕的結構。然而， 由此產生的，看似不明顯的微觀的塌陷，會影響復水性，以及藥物本身的穩定性和活性。

以下是結合使用了MicroPress 微壓力凍干餅分析儀的具體實驗方法。

二、具體實驗方法

1、配方溶液制備

樣品溶液的制備方法見表1。所有化學品均來自Sigma Aldrich。使用6ml西林瓶灌裝2ml。

表1：起始溶液的濃度

2、樣品冷凍干燥

這些小瓶用表2所示的方法冷凍干燥。預凍讓所有的樣品被冷凍，使晶體尺寸增加，樣品進入下一個階段干燥。

在干燥階段，壓力降低，使冰升華，干燥產品。所有樣品都放置在凍干機的同一個托盤上，以控制干燥過程中的可見變量。

 表2：在SP Scientific冷凍干燥機上使用的凍干工藝

3、MicroPress測量與分析

所有的樣品都在MicroPress上使用相同的一組參數進行分析 ，通過用戶友好的軟件設計，參數很容易設置，并可以更改以適應任何要求。參數設置情況見表3。

表3：MicroPress測試階段及相應的速度

Extend階段的速度為10mm/s，與估計的蛋糕高度的距離在5mm以內。Seek階段找到蛋糕的頂部，一旦感覺到力，Compress階段開始，然后記錄施加在蛋糕上的力。

4、結果分析

下表4顯示了從配方分析獲得的結果。配方1具有*高的楊氏模量，因此是*強的蛋糕。

表4：獲得的3種配方的強度結果

●   配方1的平均楊氏模量為0.969 kPa，配方1中*強的值為圖1中的橙色。該蛋糕的楊氏模量為1.246 kPa，大應力為17.600 kPa；

●  圖1中的另外兩條曲線分別表示配方2 (灰色) 和配方3 (藍色) 。配方2的楊氏模量為0.473 kPa，大應力為7 kPa；

●   配方3（藍色）看似比配方2（灰色）有一個更高的大應力，實際上真正的大應力在應變51%左右，楊氏模量為0.017 kPa，大應力為2.660 kPa，是所有被分析的蛋糕中弱的。

圖1：使用MicroPress分析的三種配方圖（配方1-橙色，配方2-灰色，配方3-藍色）

三、關于實驗的討論

表4中為本次實驗中獲得的數據。甘露醇/葡萄糖樣品溶液中的葡萄糖濃度越高，蛋糕的強度就越弱。傳統的甘露醇被用作賦形劑，已知它對許多配方的關鍵溫度有積極 的影響。然而，這可能掩蓋了一個配方可能具有的一些關鍵溫度。葡萄糖的塌陷溫度為-41.0℃，當甘露醇凍干時，塌陷在甘露醇支架上。這種蛋糕看起來很結實， 眼見的外觀良好，但當用掃描電鏡或類似的技術分析時 ，晶格看起來更“濕潤”，孔隙更寬。

當用MicroPress分析時，增加葡萄糖濃度對材料強度的影響是非常明顯的。蛋糕內的葡萄糖越多，物質強度就會減弱。當使用冷凍干燥顯微鏡(FDM)或差示掃描量熱法(DSC)進行分析時，發現樣品往往只顯示甘露醇的結晶和熔化，而甘露醇有著強大的外部結構，掩蓋了葡萄糖的玻璃化轉變。

關鍵溫度分析只揭示了甘露醇的熔化，因此當產品凍干保持樣品在-10℃以下，葡萄糖在主體材料中塌陷。因此， 由于葡萄糖的關鍵溫度較低，甘露醇通常能夠在標準的初級干燥條件下很好地干燥，而葡萄糖則不能。此外，當配方中的葡萄糖濃度增加時，蛋糕內的微塌陷程度增加，從而產生較弱的蛋糕。在儲存或運輸過程中，有微塌陷的材料更容易損壞或減少活性成分。

四、終結論

傳統上，凍干樣品的質量是由一些定性技術來確定的，包括；視覺評估，復水時間，與參考文獻相比的外在強度，水分含量。然而，這是一種主觀的分析，數據的質量可能取決于操作者的經驗。Biopharma公司開發了這種壓痕技術 ，并將其應用于凍干蛋糕，以減少主觀性，并提供凍干產品的定性數據，以確定樣品中是否存在產品缺陷。

配方中每個成分的關鍵溫度與配方的整體關鍵溫度同樣重要，凍干產品在一個看似安全的溫度會導致弱蛋糕由于凍干期間結構減弱和微塌陷影響蛋糕的強度。

一旦材料被凍干，MicroPress可以用來測試得到的蛋糕的物理特性，以及它們是否在整體強度的所需參數范圍內。在MicroPress上分析的蛋糕還可以使用卡爾-費休法測試水分含量， 如果需要玻璃化轉變溫度或熔點溫度也可以使用mDSC進行測試。

一旦確定了凍干樣品的初始曲線，可以改變配方，增加其它輔料，這可能會影響凍干蛋糕強度。如表4所示，增加材料的濃度并不一定會增加蛋糕的強度。因此，如果在運輸過程中發現蛋糕破裂或破碎的問題，則應進行輕微的改變，或包含或排除一種或多種輔料可能是有益的。