mRNA是一種很有吸引力的疫苗方式，它在抗原設(shè)計(jì)上的靈活性以及開(kāi)發(fā)和生產(chǎn)的速度，使得mRNA疫苗成為一種極為重要且經(jīng)濟(jì)效益巨大的干預(yù)手段。2020年的疫情使得mRNA疫苗和藥物受到廣泛關(guān)注，Moderna和Pfizer/BioNTech迅速開(kāi)發(fā)出非常有效的核苷修飾mRNA-LNP疫苗，采用LNP作為運(yùn)輸載體，并帶動(dòng)了mRNA領(lǐng)域研究的蓬勃發(fā)展。

                               圖1：多款Corona Virus Disease 2019 mRNA 疫苗采用LNP

            【來(lái)源：International Journal of Pharmaceutics，國(guó)金證券研究所】

小德在往期的文章“冷凍干燥技術(shù)助力新型mRNA疫苗研發(fā)與生產(chǎn)”中介紹了mRNA疫苗的研發(fā)與生產(chǎn)，今天帶大家了解一下mRNA疫苗的遞送技術(shù)LNP。

遞送mRNA有效的常用載體—LNP

mRNA分子量大、親水性強(qiáng)，但自身的單鏈結(jié)構(gòu)極不穩(wěn)定，易被降解。mRNA的有限壽命使細(xì)胞能夠快速改變蛋白質(zhì)合成以響應(yīng)其不斷變化的需求，卻難以滿足成藥性的要求。加上mRNA分子本身攜帶負(fù)電荷，難以穿過(guò)表面同為負(fù)電荷的細(xì)胞膜，所以需要特殊的修飾或包裹遞送系統(tǒng)才能實(shí)現(xiàn)mRNA藥物的胞內(nèi)表達(dá)，因此，遞送技術(shù)是mRNA公司的核心技術(shù)之一。

遞送mRNA疫苗的手段有物理方法、病毒載體方法和非病毒載體方法。脂質(zhì)體及其衍生物已成為目前遞送mRNA非常有效的非病毒載體。用于遞送mRNA疫苗的脂質(zhì)載體主要分為以下幾種：脂質(zhì)體復(fù)合物（LP），脂質(zhì)體聚合物（LPR），脂質(zhì)體納米粒（LNP），陽(yáng)離子納米乳（CNE）。

脂質(zhì)體納米粒（LNP）是mRNA藥物常用的載體。LNP是一種多組分系統(tǒng)，通常由可電離脂質(zhì)或陽(yáng)離子類(lèi)脂質(zhì)化合物、輔助脂質(zhì)、膽固醇、保護(hù)劑聚乙二醇-脂質(zhì)共軛物組成。其作用是確保長(zhǎng)鏈核酸分子的壓實(shí)，保護(hù)其在細(xì)胞外酶的作用下不降解，并提供由于內(nèi)吞作用（吞噬作用或胞吞作用），而將納米顆粒轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞中，隨后將mRNA從內(nèi)體（吞噬體）釋放到細(xì)胞質(zhì)中，用于翻譯和表達(dá)具有免疫原性表位的蛋白質(zhì)。

            圖2：LNP結(jié)構(gòu)組成

           【來(lái)源：Science】

每種LNP都由4種輔料構(gòu)成，包括可電離脂質(zhì)（與mRNA結(jié)合，將其電荷由負(fù)電荷轉(zhuǎn)化為電中性，同時(shí)限制顆粒毒性）；另3種脂質(zhì)可以維持粒子的結(jié)構(gòu)并提高穩(wěn)定性。

用LNP將mRNA包封，從而保護(hù)LNP中的mRNA，還可解決mRNA疫苗穩(wěn)定性差的問(wèn)題。為了疫苗能有效地進(jìn)行流通，我們期望mRNA-LNP疫苗好能夠在冷藏溫度（2-8°C）或更高的溫度下有足夠長(zhǎng)的有效期。目前，公開(kāi)資料中幾乎沒(méi)有關(guān)于mRNA-LNP 制劑長(zhǎng)期儲(chǔ)存穩(wěn)定性數(shù)據(jù)。Moderna和BioNTech/輝瑞的Corona Virus Disease 2019疫苗分別需要在-15~-25℃和-60~-90℃儲(chǔ)存。mRNA-LNP 需要冷凍儲(chǔ)存，對(duì)疫苗在運(yùn)輸、儲(chǔ)存和流通是個(gè)很大的挑戰(zhàn)。當(dāng)前迫切需要研發(fā)出性質(zhì)更加穩(wěn)定不需要冷凍儲(chǔ)存的mRNA-LNP疫苗。

賓夕法尼亞大學(xué)與德國(guó)BioNTech學(xué)者共同在Molecular Therapy發(fā)表過(guò)一篇文章：Lyophilization provides long-term stability for a lipid nanoparticle-formulated, nucleoside-modified mRNA vaccine。

                                圖3：Molecular Therapy研究文章

用SP Scientific VirTis Genesis 35L Pilot Lyophilizer凍干機(jī)（見(jiàn)圖4），對(duì)脂質(zhì)納米顆粒為載體的修飾核苷酸mRNA疫苗進(jìn)行了穩(wěn)定性研究。研究發(fā)現(xiàn)核苷酸修飾mRNA-LNP疫苗室溫儲(chǔ)存12周和4℃儲(chǔ)存至少24周物理化學(xué)性質(zhì)沒(méi)有顯著變化。小鼠研究中表明，螢火蟲(chóng)熒光素編碼的凍干劑型mRNA-LNP依舊可以高水平表達(dá)，在室溫儲(chǔ)存12周或4℃儲(chǔ)存至少24周后，未觀察到編碼HA的mRNA-LNP疫苗的免疫原性降低。

該研究為克服核苷修飾mRNA-LNP疫苗的長(zhǎng)期儲(chǔ)存難題提供了一個(gè)潛在的解決方案。

  圖4：SP ScientificVirTisGenesis35LPilotLyophilizer凍干機(jī)

瑞科吉生物的凍干劑型mRNA-LNPCorona Virus Disease 2019疫苗采用LNP遞送系統(tǒng)，應(yīng)用自主開(kāi)發(fā)的冷凍干燥技術(shù)實(shí)現(xiàn)了4℃和25℃條件下的制劑穩(wěn)定性。該疫苗可在常規(guī)冷鏈條件下貯存與運(yùn)輸，顯著提高了疫苗的可及性。研究成果已在 bioRxiv 在線發(fā)布，題為Lyophilized mRNA-lipid nanoparticle vaccines with long-term stability and high antigenicity against SARS-CoV-2。

作為初款凍干mRNA疫苗，若該疫苗能夠順利通過(guò)臨床成功上市，將對(duì)改變疫苗分發(fā)不均、Corona Virus Disease 2019疫情持續(xù)肆虐的困局起到關(guān)鍵作用。

                           圖5：瑞科吉生物疫苗研究成果

凍干疫苗的優(yōu)勢(shì)及工藝開(kāi)發(fā)，請(qǐng)移步往期文章“冷凍干燥技術(shù)助力新型mRNA疫苗研發(fā)與生產(chǎn)”。

mRNA-LNP疫苗的長(zhǎng)期儲(chǔ)存解決方案

SP Scientific 研發(fā)及生產(chǎn)型凍干機(jī)

關(guān)于mRNA-LNP疫苗的一些問(wèn)題

問(wèn)：如何準(zhǔn)確實(shí)現(xiàn)凍干mRNA-LNP疫苗中關(guān)鍵配方溫度測(cè)量？

                        圖6：凍干顯微鏡Lyostat5及搭配使用的DSC模塊

英國(guó)Biopharma Group公司提供的凍干顯微鏡Lyostat5及可與顯微鏡搭配使用的DSC模塊，可以輕松實(shí)現(xiàn)配方關(guān)鍵溫度（Tc, Teu, Tg’)的測(cè)量。

問(wèn)：如何快速實(shí)現(xiàn)mRNA-LNP凍干工藝開(kāi)發(fā)和優(yōu)化？

SP Scientific提供的Lyostar凍干機(jī)僅需運(yùn)行一個(gè)遁環(huán)即可自動(dòng)摸索和開(kāi)發(fā)凍干工藝。結(jié)合前沿的凍干PAT技術(shù)（Smart 全自動(dòng)工藝開(kāi)發(fā)技術(shù)，Controlyo晶核控制技術(shù)，TDLAS實(shí)時(shí)水蒸汽測(cè)量技術(shù)），使漫長(zhǎng)復(fù)雜的工藝摸索變得簡(jiǎn)單快捷有效。

         圖7：Lyostar 全智能凍干工藝開(kāi)發(fā)與優(yōu)化

問(wèn)：是否有凍干mRNA-LNP疫苗的案例？

輝瑞、莫德納，阿斯利康、強(qiáng)生均已在使用SP Scientific Lyostar智能工藝開(kāi)發(fā)凍干機(jī)進(jìn)行Corona Virus Disease 2019凍干疫苗的研發(fā)。