隨著大家對(duì)疫情的關(guān)注度迎來(lái)又一波熱潮，對(duì)疫苗的關(guān)心和問(wèn)題也沖上熱搜。

目前不同廠家的疫苗有什么區(qū)別？為什么有的疫苗只需接種一劑，有的則需要接種兩劑或三劑？應(yīng)該選擇什么類型的疫苗？不同疫苗的有效性是否有差異？疫苗加強(qiáng)針是否應(yīng)該接種，該怎么選擇？有沒(méi)有有效性更高、且穩(wěn)定性好的疫苗？

關(guān)于疫苗研發(fā)的5條技術(shù)路線

我們先來(lái)了解一下什么是疫苗？

疫苗是預(yù)防和控制傳染病十分經(jīng)濟(jì)、有效的手段，疫苗接種是通過(guò)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答來(lái)預(yù)防和控制人類和動(dòng)物疾病的常規(guī)方法。自疫情初期開(kāi)始，我國(guó)與全球主要國(guó)家就投入了此次疫情疫苗的研發(fā)工作，并行開(kāi)發(fā)了5條技術(shù)路線的疫苗，這也是目前疫苗的主要分類。

疫苗的不同技術(shù)路線：

※ 滅活疫苗

※ 減毒活疫苗

※ 基因工程亞單位疫苗

※ 腺病毒載體疫苗

※ 核酸疫苗

（含DNA和RNA疫苗）

滅活疫苗是十分傳統(tǒng)的平臺(tái)，而亞單位蛋白疫苗在過(guò)去幾十年中蓬勃發(fā)展，核酸和病毒載體疫苗是該領(lǐng)域重要的新生事物。核酸疫苗使用先進(jìn)的基因工程RNA或DNA產(chǎn)生一種自身可以安全誘發(fā)免疫應(yīng)答的蛋白質(zhì)。相較于DNA而言，RNA更容易被人體識(shí)別并產(chǎn)生相應(yīng)的抗原信息，但不會(huì)參與細(xì)胞內(nèi)DNA的改造，因而更加高效且安全性更高。

不同疫苗的有效性如何呢？

此次疫苗在產(chǎn)量方面處于突出地位的是美國(guó)輝瑞-BioNTech和Moderna（mRNA疫苗）、阿斯利康和強(qiáng)生（病毒載體）以及中國(guó)國(guó)藥集團(tuán)和科興（滅活）。各疫苗的有效性如何呢？世界衛(wèi)生組織公布的數(shù)據(jù)如下：

從數(shù)據(jù)來(lái)看，輝瑞-BioNTech和Moderna（mRNA疫苗）有效性較高，分別為95%和94.1%。

為了應(yīng)對(duì)病毒的持續(xù)變異，建議盡早接種疫苗加強(qiáng)針。為確保同等或更有利的免疫原性或疫苗有效性，在第一劑和第二劑接種滅活疫苗后，視產(chǎn)品供應(yīng)情況，第三劑既可繼續(xù)接種同品牌的滅活疫苗，也可接種世衛(wèi)組織緊急使用列表中的任一種 mRNA 疫苗（輝瑞或莫德納）或該病毒載體疫苗（阿斯利康Vaxzevria/COVISHIELD或楊森）。

mRNA疫苗的優(yōu)勢(shì)在哪里？

代表著未來(lái)新技術(shù)的mRNA疫苗是將外源靶抗原的基因序列通過(guò)轉(zhuǎn)錄、合成等工藝制備的mRNA通過(guò)特定的遞送系統(tǒng)導(dǎo)入機(jī)體細(xì)胞，通過(guò)在體內(nèi)表達(dá)目的蛋白，刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫學(xué)反應(yīng)，從而使機(jī)體獲得免疫保護(hù)的一種核酸制劑，能實(shí)現(xiàn)體液與細(xì)胞的雙重免疫，有效性高。

mRNA疫苗作為一種平臺(tái)型技術(shù)，在設(shè)計(jì)和構(gòu)建上具有快速性、應(yīng)變性以及簡(jiǎn)單的全合成制備等優(yōu)勢(shì)，疫情在全球范圍爆發(fā)和蔓延后，隨著Moderna和BioNtech公司的mRNA疫苗在臨床上的安全性和保護(hù)效力得到進(jìn)一步驗(yàn)證，使得mRNA疫苗技術(shù)得到廣泛關(guān)注并推動(dòng)了其快速發(fā)展。

冷凍干燥技術(shù)在mRNA疫苗研發(fā)和生產(chǎn)中的應(yīng)用

mRNA疫苗雖然有效性高，但在生產(chǎn)和使用過(guò)程中依然存在一些挑戰(zhàn)——

① 結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定；

② 容易被環(huán)境中普遍存在的RNA酶降解破壞；

③ 需要在零下-20℃～-70℃之間保存。

這就意味著全程需要冷凍儲(chǔ)存和冷鏈運(yùn)輸，配送和使用會(huì)變得非常困難，尤其是對(duì)于醫(yī)療條件和運(yùn)輸條件相對(duì)較差的非洲、南美洲和部分亞洲國(guó)家等，因此會(huì)造成由于無(wú)法按時(shí)接種終導(dǎo)致仍有數(shù)百萬(wàn)人死于這些疾病。

                                                                                  圖2：凍干疫苗可以解決儲(chǔ)存運(yùn)輸難題

而這些難題可以通過(guò)凍干生產(chǎn)相對(duì)較為干燥的產(chǎn)品來(lái)解決。目前，冷凍干燥技術(shù)由于其*的優(yōu)勢(shì)，已被廣泛應(yīng)用于抗體、疫苗等生物制藥中。

1、凍干疫苗的優(yōu)勢(shì)

●   疫苗制劑在預(yù)凍前完成分裝，從而保證了劑量的精確性；

●   由于凍干是在真空和低溫狀態(tài)下完成的，因此不易發(fā)生氧化和熱變性，可以大限度地保持疫苗的理化性質(zhì)和生物特性；

●   固態(tài)的冰晶升華成為水蒸氣后形成的疏松多孔（海綿狀）結(jié)構(gòu)，使凍干疫苗具有非常好的速溶性和復(fù)水性，可迅速吸水溶解，恢復(fù)其原有特性；

●   凍干疫苗易進(jìn)行無(wú)菌化操作，污染相對(duì)減少，臨床應(yīng)用效果好，過(guò)敏等副作用少；

●  凍干疫苗脫水*，含水量低，重量輕，適合長(zhǎng)途運(yùn)輸及長(zhǎng)期保存；

●   凍干疫苗可以在室溫下保存，減少冷鏈運(yùn)輸?shù)某杀荆娱L(zhǎng)貨架期。

2、凍干疫苗所面臨的挑戰(zhàn)

凍干疫苗具有顯著的優(yōu)勢(shì)，但必須克服一些挑戰(zhàn)。

復(fù)雜的制劑，尤其是由多種菌株或多種抗原組成的疫苗，可能導(dǎo)致具有挑戰(zhàn)性的關(guān)鍵配方溫度和復(fù)雜的冷凍干燥過(guò)程。冷凍和干燥會(huì)對(duì)疫苗造成一定的影響，疫苗凍干過(guò)程的敏感性程度因疫苗而異。內(nèi)部結(jié)冰和對(duì)疫苗成分（例如脂質(zhì)膜、核酸或蛋白質(zhì)）的直接損害可能是應(yīng)力因素。

在冷凍過(guò)程中會(huì)形成病毒內(nèi)冰晶，這會(huì)增加產(chǎn)品的體積并可能損壞脂質(zhì)雙層（如圖3 所示）。冰還會(huì)在冰和液體之間產(chǎn)生新的界面，并增加表面誘導(dǎo)聚集的風(fēng)險(xiǎn)。

                                                                                                 圖3：冷凍干燥過(guò)程中的應(yīng)力因素

在關(guān)鍵配方溫度以上干燥會(huì)導(dǎo)致無(wú)定形相在凍干循環(huán)的初級(jí)干燥步驟中的流動(dòng)性提高。這使得蛋白質(zhì)相互作用并可以提高膜通透性。

在去除結(jié)合水的二次干燥階段，可能會(huì)發(fā)生蛋白質(zhì)聚集和失活。在磷脂存在的情況下，熱致相變的改變也可以提高膜滲透性。二次干燥直接影響殘留水分含量，從而影響長(zhǎng)期穩(wěn)定性。

3、凍干疫苗配方所需特性

理想的情況是，疫苗須在干燥狀態(tài)下長(zhǎng)期儲(chǔ)存和液體狀態(tài)下至少保持24 小時(shí)穩(wěn)定。為了實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，必須以適當(dāng)?shù)呐浞胶凸に囬_(kāi)發(fā)疫苗。

穩(wěn)定劑（冷凍或冷凍保護(hù)劑）在開(kāi)發(fā)穩(wěn)定的疫苗配方中起著關(guān)鍵作用。無(wú)定形冷凍保護(hù)劑，如糖類和糖醇，在冷凍過(guò)程中通過(guò)優(yōu)先排除冷凍保護(hù)劑和蛋白質(zhì)的水合作用在熱力學(xué)上保持穩(wěn)定（如下圖4 所示）。

                                                                                                                圖4：優(yōu)先排除理論

它們還通過(guò)玻璃化作用提供動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性，從而減緩蛋白質(zhì)和脂質(zhì)膜的聚集。一些冷凍保護(hù)劑，如葡聚糖，不能滲透化合物，但通過(guò)增加滲透梯度，也能夠阻止內(nèi)部結(jié)冰。

一些凍干保護(hù)劑，如右旋糖酐，不能滲透該化合物，但可以通過(guò)增加滲透梯度來(lái)抑制內(nèi)部結(jié)冰。凍干保護(hù)劑通過(guò)替換水和磷脂或蛋白質(zhì)之間的氫鍵，在冷凍干燥循環(huán)的干燥階段發(fā)揮作用(如圖5所示)。與凍干保護(hù)劑一樣，通過(guò)玻璃化來(lái)實(shí)現(xiàn)動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定，使蛋白質(zhì)和脂質(zhì)膜的流動(dòng)性得以實(shí)現(xiàn)，從而達(dá)到結(jié)構(gòu)和構(gòu)象的穩(wěn)定。

                                                                                                             圖5：水替代理論

為了提高疫苗的穩(wěn)定性，可以在制劑中加入其他賦形劑，例如緩沖劑、使表面引起的不穩(wěn)定小化的表面活性劑和不太常用的賦形劑，例如填充劑、有機(jī)共溶劑和張力調(diào)節(jié)劑。

案例研究——開(kāi)發(fā)一種具有三種滅活血清型的耐熱凍干脊髓灰質(zhì)炎疫苗

通過(guò)使用實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(DoE) 方法，用多種賦形劑評(píng)估了脊髓灰質(zhì)炎疫苗的不同配方，并檢查了血清型的穩(wěn)定性。用有*的賦形劑進(jìn)行基本篩選沒(méi)有顯示出穩(wěn)定的產(chǎn)品，因此進(jìn)行了廣泛的篩選，成功鑒定了穩(wěn)定劑。與液體制劑和其他市售脊髓灰質(zhì)炎疫苗制劑相比，對(duì)佳候選物進(jìn)行優(yōu)化產(chǎn)生了具有高熱穩(wěn)定性的終制劑。

4、凍干疫苗工藝開(kāi)發(fā)

冷凍對(duì)產(chǎn)品特性有重要影響，進(jìn)而影響產(chǎn)品穩(wěn)定性(如圖6所示)。緩慢冷凍會(huì)導(dǎo)致形成少量的大晶體，這可能對(duì)膜有害。快速冷凍減少了滲透水釋放的時(shí)間，但是會(huì)產(chǎn)生更大的內(nèi)部結(jié)冰風(fēng)險(xiǎn)。快速或慢速冷凍之間的選擇是困難的，但會(huì)很容易受疫苗配方和敏感性的影響。因此，在凍干循環(huán)開(kāi)發(fā)過(guò)程中研究冷凍速率對(duì)穩(wěn)定性的影響至關(guān)重要。

                                                                                                                    圖6：凍結(jié)速率的影響

產(chǎn)品溫度在整個(gè)初級(jí)干燥步驟中至關(guān)重要，它會(huì)影響干燥時(shí)間、升華速率和穩(wěn)定性。在優(yōu)化疫苗的主要干燥參數(shù)時(shí)，值得考慮減少干燥時(shí)間與產(chǎn)品穩(wěn)定性的成本效率。

在二次干燥期間去除水合殼會(huì)降低產(chǎn)品穩(wěn)定性。殘留水分增加還會(huì)導(dǎo)致坍塌、聚集和降解。因此，佳殘留水分含量和二次干燥條件也應(yīng)該是開(kāi)發(fā)階段的一部分。

案例研究——初級(jí)干燥過(guò)程中產(chǎn)品溫度對(duì)長(zhǎng)期穩(wěn)定性的重要性

在所檢查的細(xì)菌疫苗的示例中，基于產(chǎn)品溫度(Tp) 測(cè)試了三個(gè)不同的循環(huán)，并在穩(wěn)定性方面分析了產(chǎn)品特性。通過(guò)比較凍干后活細(xì)菌疫苗的活細(xì)胞計(jì)數(shù)來(lái)量化穩(wěn)定性。

冷凍干燥后立即保守 [Tp 遠(yuǎn)低于崩潰溫度（Tc ）但高于玻璃化轉(zhuǎn)變溫度（Tg ' ）]和激進(jìn)循環(huán)（Tp 高于Tc ）之間沒(méi)有區(qū)別。

激進(jìn)周期在幾天和一個(gè)月后表現(xiàn)不佳，中間（Tp 在Tc ）和激進(jìn)周期不如保守周期好（如圖7 所示）。建議使用保守條件開(kāi)始干燥周期，但對(duì)于某些疫苗制劑，高于Tc 的初級(jí)干燥可能不會(huì)導(dǎo)致穩(wěn)定性損失。

                                                                      圖7：臨界配方溫度(CFT)與冷凍干燥條件對(duì)疫苗穩(wěn)定性的影響的相關(guān)性

那么問(wèn)題來(lái)了

Q1：如何準(zhǔn)確實(shí)現(xiàn)凍干疫苗中關(guān)鍵配方溫度測(cè)量？

                                                                                       圖8  ：凍干顯微鏡Lyostat5及搭配使用的DSC模塊

英國(guó)Biopharma Group公司提供的凍干顯微鏡Lyostat5及可與顯微鏡搭配使用的DSC模塊，可以輕松實(shí)現(xiàn)配方關(guān)鍵溫度（Tc, Teu, Tg’)的測(cè)量。

Q2：如何快速實(shí)現(xiàn)疫苗凍干工藝開(kāi)發(fā)和優(yōu)化？

SP Scientific提供的Lyostar凍干機(jī)僅需運(yùn)行一個(gè)遁環(huán)即可自動(dòng)摸索和開(kāi)發(fā)凍干工藝。結(jié)合高超的凍干PAT技術(shù)（Smart 全自動(dòng)工藝開(kāi)發(fā)技術(shù)，Controlyo晶核控制技術(shù)，TDLAS實(shí)時(shí)水蒸汽測(cè)量技術(shù)），使漫長(zhǎng)復(fù)雜的工藝摸索變得簡(jiǎn)單快捷有效。

                       圖9：Lyostar 全智能凍干工藝開(kāi)發(fā)與優(yōu)化

Q3：是否有凍干疫苗的案例？

輝瑞、莫德納，阿斯利康、強(qiáng)生均已在使用SP Scientific Lyostar智能工藝開(kāi)發(fā)凍干機(jī)進(jìn)行凍干疫苗的研發(fā)。

The Pfizer/BioNTech Comirnaty vaccine, 31 December 2020.

The SII/COVISHIELD and AstraZeneca/AZD1222 vaccines, 16 February 2021.

The Janssen/Ad26.COV 2.S vaccine developed by Johnson & Johnson, 12 March 2021.

滅活疫苗是傳統(tǒng)成熟的技術(shù)路線。RNA疫苗有效性較高，代表著未來(lái)疫苗新技術(shù)和新趨勢(shì)。冷凍干燥是提高疫苗熱穩(wěn)定性的理想技術(shù)。凍干疫苗制劑開(kāi)發(fā)應(yīng)探索凍干保護(hù)劑和冷凍保護(hù)劑、其他穩(wěn)定賦形劑的選擇以及凍干過(guò)程中的冷凍干燥工藝的影響，以防止對(duì)疫苗造成任何損害。

在開(kāi)發(fā)項(xiàng)目中，應(yīng)根據(jù)配方和工藝問(wèn)題考慮對(duì)工藝條件的影響，以及它如何影響產(chǎn)品質(zhì)量屬性。通過(guò)了解這些潛在機(jī)制，結(jié)合先進(jìn)的PAT工具和QbD理論，實(shí)現(xiàn)快速合理開(kāi)發(fā)，終獲得有效性高、長(zhǎng)期穩(wěn)定性好的預(yù)防疫苗和治療疫苗，快速預(yù)防和消除人類疾病！