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摘要

為了實現由RNA干擾(RNAi)途徑介導的有效的治療性轉錄后基因沉默，必須對小干擾RNA(siRNA)進行化學修飾。幾種具有穩定siRNA代謝潛力的超RNA結構已被評估其誘導基因沉默的能力，但它們都有局限性或尚未在治療相關背景下進行探索。共價閉合環狀RNA轉錄物在真核生物中普遍存在，具有作為生物標志物和疾病靶點的潛力，環狀RNA模擬物正在被探索用于治療。在這里，我們報道了小環狀干擾RNA(sciRNAs)的合成和評價。為了合成sciRNA，用三價N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)配體功能化并使用“click"化學環化的正義鏈被退火成反義鏈。這種策略用于合成小圓環，但也可用于合成較大的環狀RNA模擬物。我們在體外和體內評估了各種sciRNA設計。我們觀察到循環后正義鏈的代謝穩定性得到改善，脫靶效應被消除。反義鏈的5'-(E)-乙烯基膦酸鹽修飾導致GalNAc-sciRNA在體內的治療相關劑量有效。物理化學研究和基于核磁共振的結構分析，以及分子模型研究，揭示了這類具有部分雙鏈特征的新型siRNA與RNAi機制的相互作用。

圖1 (A) sciRNA中使用的化學修飾。(B) GalNAc -偶聯sciRNA示意圖。

圖2 sciRNA-GalNAc偶聯物點擊環正義鏈的合成。簡稱:Q, 6-疊氮己基柄; Y: 炔羥基脯氨酸磷酰胺; L, GalNAc配體; Z, 連接子。

表1 線性GalNAc-siRNA和環狀GalNAc-siRNA的序列、熱穩定性和體外效力。

正義鏈序列是最上面的行;反義鏈序列為底行。Z表示環狀寡核苷酸。化學修飾如下：•，PS鍵; 小寫的核苷酸，2'-OMe; 大寫的核苷酸用斜體表示，2'-F; Q,6-azidohexyl-phosphate; 副VP,5'-(E)-vinylphosphonate。

血漿和肝臟勻漿中寡核苷酸穩定性分析

用10倍輔助因子溶液稀釋大鼠血漿(BioIVT,Cat# RAT00PL38NCXNN)和肝臟勻漿(BioIVT，定制訂單)，最終濃度為1mM MgCl2, 1mM MnCl2和2mM CaCl2。將sciRNA加入到50μl的血漿或肝臟勻漿中，最終濃度為20μg/ml。反應混合物在37℃下輕搖孵育。在每個預定時間點(0,1,4,8和24h)，加入450μL含有內標(寡核苷酸U21，終濃度為1μg/ml)的Clarity OTX裂解上樣緩沖液(Phenomenex,Cat# AL0-8579)停止反應，并在-80°C冷凍至分析。實驗一式三次。

使用Liu等人(49)描述的Clarity OTX 96孔固相萃取板進行LC-MS分析的寡核苷酸富集。固相萃取柱初始用1 ml甲醇，然后用2ml 50mM醋酸銨和2mM在HPLC級水中平衡。樣品通過正壓加載到固相萃取柱上。然后用1ml 50mM乙酸銨在50/50(v/v)水和乙腈(pH5.5)中洗滌5次。最后，用含有10mM EDTA, 100mM碳酸氫銨的洗脫緩沖液在40/10/50(v/v/v)乙腈/四氫呋喃/水(pH8.8)中洗脫寡核苷酸。洗脫液在氮氣下干燥，重懸于120μl LC-MS級水中進行LC-MS分析。

結果

大鼠血漿和肝臟勻漿已被用于表征GalNAc偶聯寡核苷酸的代謝。在長達8小時的血漿中檢測到環狀或線性siRNA鏈均未降解(圖4A)。然而，在我們的LC-MS代謝物分析中，我們觀察到在大鼠血漿中孵育24小時后，環狀鏈上增加了一個水分子。從大鼠肝臟勻漿或血漿中鑒定si-4的代謝物見補充表S4，從大鼠肝臟勻漿或血漿中鑒定si-5的代謝物見補充表S5。我們的理論認為，這種物種是由于開放的環狀結構產生線性化的寡核苷酸。在大鼠肝臟勻漿中，環形sciRNA(si-4和si-5)比線性sciRNA(si-3)更穩定。在24h時si-4或si-5沒有降解，而對于si-3，在24h時僅檢測到全長正義鏈的約55%(圖4B)。與具有4小時半衰期的線性siRNA相比，sciRNA的半衰期明顯更長，為29和30小時。這與單鏈穩定性分析的結果有關，其中環化增強了外切酶存在下的穩定性。在肝臟勻漿中，我們沒有觀察到si-4或si-5的正義鏈的環狀結構打開。

圖4 線性GalNAc-siRNA si-3和GalNAc-sciRNAs與環狀正義鏈si-4和si-5在血漿和肝臟勻漿中孵育后全長正義鏈的穩定性使用LC-MS測量。(A)大鼠血漿或(B)大鼠肝臟勻漿中剩余全長正義鏈百分比(log10)。用誤差條表示每個時間點三個重復的標準差。

結論

作為RNAi療法，sciRNAs可以提供包括代謝穩定在內的有益特性，從而延長作用時間，減少脫靶結合。進一步的環狀RNA結構可以設計成定制的三維結構，從而影響組織分布和組織保留，最大限度地減少不希望的蛋白質結合，并優化由于物理性質變化而導致的配體-受體相互作用。在RNAi治療的當前前景中，許多已批準的藥物和人類臨床試驗中的高級候選藥物已經優化為靶向遞送到肝臟。類似的藥物設計規則是否會普遍適用于siRNA成功遞送到肝外組織和各種相關細胞類型，還有待觀察。沿著這些具有挑戰性的路線工作，需要探索新的化學和結構修飾類別。了解結構基序對效力和安全性的影響將為未來開發細胞和組織特異性遞送RNAi療法鋪平道路。具有修飾結構的siRNA也將擴展RNAi療法的工具箱，當將脫靶減少和增強代謝穩定納入初始RNAi篩選過程時，將提供額外的益處。