納米紅外光譜探測細胞外囊泡的結構和異質性

摘要：細胞外囊泡（EVs）是細胞主動釋放的納米級膜囊泡。最初EVs被認為是細胞碎片，并且因此被低估，但是EVs現在越來越被認為是細胞間通訊的重要介質，它們在許多生理和病理過程中發(fā)揮著重要作用。EV是異質性的，更好地了解EV的分子組成和異質性是設計下一代生物傳感器以進行早期疾病診斷和開發(fā)基于EV的新興療法的基礎，這已經在癌癥診斷和治療中顯示出巨大的前景。傳統的方法不具有表征單個EVs個體的分辨率和靈敏度，因此破譯單個EV的結構和組成仍然是難題。

布魯克納米紅外光譜儀（nanoIR）采用光熱誘導共振技術(AFM-IR)實現微小區(qū)域紅外信號的采集。紅外激光照射到樣品上，樣品吸收輻射光產生熱膨脹，這種熱膨脹引發(fā)探針的震蕩，通過監(jiān)控探針的震蕩強度獲得紅外吸收強度。AFM-IR利用原子力探針作為樣品紅外吸收的傳感器，實現了超高靈敏度的光譜和紅外成像探測，化學成像分辨能力可以達到10nm。近期，澳大利亞悉尼大學悉尼藥學院團隊將納米紅外光譜方法引入到單個EV結構的檢測中，展示了其在同一EVs和不同EVs群體之間揭示個體EVs異質性的能力。此方法無標記，能夠檢測單個EV中的脂質，蛋白質和核酸。通過AFM-IR對EV組成和結構的新認識將有助于我們對EVs的生物學理解，并可用于疾病診斷和EVs療法的開發(fā)。相關研究成果以High-fidelity probing of the structure and heterogeneity of extracellular vesicles by resonance-enhanced atomic force microscopy infrared spectroscopy為題，發(fā)表在Nature Protocols上。

實驗內容：為了驗證納米紅外具有探測不同細胞類型囊泡的分子組成的能力，作者分別從兩個特征良好的hTERT轉化人蛻膜（DMSC23）和絨毛膜（CMSC29）間充質基質細胞系中分離EVs，期望這兩種細胞系能夠產生結構和組成不同的EVs。將含有EV樣品的液滴滴在基片（如ZnS, 云母或金等）干燥一晚，獲得待測樣品。通過分析紅外光譜的峰位和峰強，可以確定DNA（1050–1290 cm−1），RNA（1250–1380 cm−1），蛋白質（1500–1750 cm−1）和磷脂（1000–1250 cm−1, 1730–1750 cm−1; 2800–3000 cm−1）的存在。

圖2 顯示了同一EV群體內不同顆粒的異質性。藍色標記的較大囊泡的光譜表現出更強的1725 cm-1（脂肪酸）和1240 cm-1（磷脂）吸收，這與囊泡表面和內部的脂質和核酸數量增多相一致。表征RNA的1124 cm-1的吸收在不同囊泡中強度不同，表明這些EVs中含有不同數量的RNA核糖。這些數據表明AFM-IR有足夠的靈敏度揭示單個EVs分子組成在納米尺度上的差異。

圖3顯示了CMSC29和DMSC23細胞分離的EVs亞群的AFM-IR光譜和成像。酰胺I的吸收峰在1500 cm-1 – 1800 cm-1范圍，可歸因于不同濃度和類型的核酸。

圖4的數據驗證了AFM-IR 表征不同細胞類型EVs的能力。DMSC23 EV具有更強的1556 cm-1和1452 cm-1，分別為酰胺I和脂酰CH2基團的彎曲振動；DMSC29 EV表現出來的1124 cm-1,1087 cm-1,1044 cm-1吸收則為磷脂、甘油三酯和膽固*醇酯的拉伸振動，來自于EV中的脂質成分，屬于核糖核酸。

總結：作者使用AFM-IR以超高分辨率探測整個EV群體，亞群和個體EV的組成和結構。實驗證實納米紅外能夠測量相同EV群體中，或不同EV群體之間的單個EV分子組成的細微差異。作者預測，在不久的將來，EV的AFM-IR表征極有可能釋放EV作為診斷和治療工具的全部潛力。

本文轉載自布魯克納米表面儀器部

• 布魯克nanoIRAFM紅外原子力顯微鏡

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