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高通量蛋白質(zhì)穩(wěn)定性分析DSF系統(tǒng)

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公司名稱 英國應(yīng)用光物理公司上海代表處
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型號
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廠商性質(zhì) 生產(chǎn)廠家
更新時間 2024/12/12 13:52:11
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產(chǎn)品標(biāo)簽

蛋白質(zhì)穩(wěn)定性分析DSF 高通量DSF分析儀高通量蛋白質(zhì)穩(wěn)定性分析蛋白質(zhì)穩(wěn)定性分析儀 SUPR-DSF

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Applied Photophysics Ltd. (APL)

英國Applied Photophysics Ltd(英國應(yīng)用光物理公司上海代表處）是專業(yè)科學(xué)儀器研發(fā)制造公司, 圓二色CD光譜儀、停流stopped flow 反應(yīng)動力學(xué)分析儀、激光閃解Laser Flash Photolysis 分析儀（瞬態(tài)吸收光譜儀）等廣泛應(yīng)用于分子空間結(jié)構(gòu)與構(gòu)象、分子間相互作用、快速反應(yīng)動力學(xué)分析等領(lǐng)域的研究，特別是生物大分子之間、生物大分子與有機小分子如藥物、各類手性化合物等的結(jié)構(gòu)與相互作用的研究。

Chirascan 系列圓二色CD光譜儀為靜態(tài)圓二色光譜分析樹立了新的標(biāo)準(zhǔn)，采用多種新技術(shù)、新設(shè)計，使光強度達(dá)到大，特別是遠(yuǎn)紫外區(qū)。它的先進(jìn)、精密的數(shù)字式數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)可實現(xiàn)快速、準(zhǔn)確的光譜采集。

包括和可配置多種功能模塊（吸收absorbance 、熒光Fluoresence 、全熒光譜、線二色（LD）、熒光探測圓二色（FDCD) 、同步三維熒光CCD檢測、熒光偏振各向異性譜FP ( Fluoresence Polarization )、熒光圓二色CPL （圓偏振發(fā)光）、磁CD(MCD ）、ORD （旋光色散）、低溫檢測附件、滴定系統(tǒng)、固態(tài)粉末樣品的透射法檢測、漫反射法積分球檢測裝置、停流Stopped flow 系統(tǒng)等）、CPL圓偏振發(fā)光等檢測附件，以使各種研究目的都能得到高標(biāo)準(zhǔn)高質(zhì)量的、可靠的、可驗證的結(jié)果數(shù)據(jù)。有大量高水平的科研論文和基礎(chǔ)研究成果的數(shù)據(jù)出自本系列儀器。

在藥物研發(fā)、藥物篩選等基礎(chǔ)應(yīng)用研究上是常用的基本的研究工具，業(yè)界熟悉的制藥公司如Amgen 、GSK, 阿斯利康A(chǔ)straZeneca 、諾和諾德、禮萊Eli Lilly 、羅氏Roche ，健贊Genzyme 、BMS、Riverside 等均有多臺本系列儀器在各個研究組發(fā)揮著重要的作用。

英國 Applied Photophysics( 應(yīng)用光物理) 生產(chǎn)的型號為 Chirascan 系列的圓色CD(circular dichroism) 光譜儀，在國內(nèi)的清華大學(xué) （目前6套）、北京大學(xué)（目前2套）、武漢大學(xué)（目前２套）、四川大學(xué)（目前３套）　、中山大學(xué)（目前３套）　、華南理工大學(xué)（目前３套）、山東大學(xué)（目前２套）、復(fù)旦大學(xué)（2套）、上海科技大學(xué)（2套）、中科院生物物理所、中科院化學(xué)所、中科院微生物所（目前３套）　、中科院上海藥物研究所、中科院上海有機所、中科院上海應(yīng)用物理研究所、中科院上海生化細(xì)胞所、中科院上海巴斯德研究所、中科院武漢病毒所、中科院物理數(shù)學(xué)研究所、中科院蘇州納米所、中科院寧波材料所、中科院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院、中國食品藥品檢驗研究院、上海藥明康德制藥、上海中科新生命生物技術(shù)公司、上海恒瑞制藥、上海復(fù)宏漢霖制藥、上海三生國健制藥、北京神州細(xì)胞生物技術(shù)公司、深圳翰宇制藥、山東新時代制藥等的實驗室有很好的應(yīng)用，并有很好的影響因子的文獻(xiàn)引用和發(fā)表。

CD圓二色光譜儀 Chirascan , Chirascan-plus， Chirascan VX , Chirascan V100,, Chirascan Q100 Circular Dichroism Spectrometers

Chirascan and Chirascan-plus， Chirascan V100 are the world's most advanced circular dichroism (CD) spectrometers. They are widely used in the study of the higher structures of bio-macromolecules, such as proteins and DNA, and how these structures change on interaction with other molecular entities. Their many innovative features provide the scientist with easy-to-use, productive tools that deliver circular dichroism spectra of a quality and on a timescale that has until recently been impossible.

停流（stopped flow）技術(shù),用于研究溶液體系的非?？焖俚姆磻?yīng)的動力學(xué)機理,反應(yīng)的時間一般在0.001秒到秒時間量級,通過研究瞬時反應(yīng)動力學(xué)現(xiàn)象可反映反應(yīng)的速度、機理、短時間存在過的反應(yīng)中間過渡態(tài)等基礎(chǔ)信息。

英國 Applied Photophysics Ltd ( 應(yīng)用光物理公司) 生產(chǎn)的型號為 SX20 系列的停流光譜儀，以及之前的系列如SX 18 MV, SX 17 , SX 15 , SX 12 等，數(shù)據(jù)引用率占可檢索到的已發(fā)表的文獻(xiàn)的八成以上。

可選擇配置的功能模塊為：時間分辨的吸收分析、二級管陣列檢測器PDA 、雙熒光檢測、熒光偏振FP (Fluoresence Polarization )檢測，多通道序列混合系統(tǒng)、淬滅停流(Quench Flow ) 檢測、電化學(xué)檢測，及CD圓二色停流分析系統(tǒng)等。

SX20 停流光譜儀 SX20 Stopped-Flow Spectrometer

The SX20 is the latest in the SX range of stopped-flow reaction analysers from Applied Photophysics and is used to study transient and pre-steady-state kinetics of fast, liquid-phase reactions. The SX range has, since its introduction over 15 years ago, established itself as the first choice of those involved in stopped-flow kinetic research. The SX20 and its predecessors offer unrivalled performance, as well as a host of upgrade opportunities for the detailed investigation of chemical and biochemical reaction mechanisms.

RX.2000 快速混合停流裝置，可與多種型號的紫外可見分光光度計（如Agilent 8453, 8454 ，瓦里安 Cary 50,100, 300 ， 3000等）、熒光光譜儀（如日立 Hitachi 熒光 F-4000, F-4500, F-4600, F-7000等各型號熒光光譜儀, 瓦里安系列熒光光譜儀、PE各型號熒光光譜儀等）、CD光譜儀聯(lián)用，研究毫秒時間量級的快速動力學(xué)反應(yīng)。小巧方便，經(jīng)濟(jì)適用。

RX.2000 Rapid Mixing Stopped-Flow Unit

The RX.2000 provides the means to measure stopped-flow rapid reaction kinetics using any UV-visible spectrometer, fluorometer or CD spectropolarimeter. This high performance, cost effective unit enables reactions to be studied that are at least a thousand fold faster than those accessible manually.

在蓬勃發(fā)展的生物制藥領(lǐng)域：

英國應(yīng)用光物理公司 Applied Photophysics Ltd ，做為專業(yè)的圓二色CD光譜儀和停流光譜儀儀器制造商，Chirascan 系列圓二色CD光譜儀是分析生物大分子如蛋白質(zhì)、DNA 、多肽等的高級結(jié)構(gòu)（二級結(jié)構(gòu)，三級結(jié)構(gòu)）的經(jīng)典方法，在國內(nèi)外的生物制藥領(lǐng)域廣泛應(yīng)用， Chirascan 系列圓二色光譜儀在圓二色檢測的精確度、準(zhǔn)確度等方面相比傳統(tǒng)圓二色儀器都有了革命性的提高，從而大大擴展了圓二色光譜CD的應(yīng)用，特別是在生物制藥行業(yè)的高級結(jié)構(gòu)表征、高級結(jié)構(gòu)相似性比較研究，配套符合FDA行業(yè)指南的數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)分析方法及軟件便于業(yè)內(nèi)人士的數(shù)據(jù)處理和分析。大量的同行業(yè)用戶，便于數(shù)據(jù)的互相比對互相核驗、評估和互相認(rèn)可。

與生物制藥行業(yè)的發(fā)展與時俱進(jìn)，英國應(yīng)用光物理公司 Applied Photophysics推出了蛋白質(zhì)化學(xué)穩(wěn)定性分析解決方案 SUPR-CM ，用于篩選合適的蛋白質(zhì)濃度，從而更快地篩選formulation或者藥物候選體篩選，其快速（ 384孔板， 2.5分鐘掃描一塊板）、自動化、高通量，高靈敏度高質(zhì)量的數(shù)據(jù)（CCD 熒光檢測），可以設(shè)置任意incubation 時間如24小時， 48小時，甚至更長（不同于目前市場上局限于2小時內(nèi)等）等*的技術(shù)設(shè)計，受到業(yè)內(nèi)人士的歡迎。

展開

圓二色光譜儀，停流stopped flow光譜儀，激光光解光譜儀，動力學(xué)分析儀

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應(yīng)用領(lǐng)域	綜合

　　高通量蛋白質(zhì)穩(wěn)定性分析中的差示掃描熒光法(Differential Scanning Fluorimetry，DSF)是一種基于蛋白質(zhì)熱變性過程的熒光檢測方法。

　　蛋白質(zhì)穩(wěn)定性

　　蛋白質(zhì)穩(wěn)定性是生物技術(shù)藥物重要的關(guān)鍵質(zhì)量屬性之一，它決定了生物藥物的藥效、生產(chǎn)可行性、安全性及保質(zhì)期。蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性確保了蛋白質(zhì)在其貨架壽命期內(nèi)保持活性和安全。

　　穩(wěn)定性研究被用來確認(rèn)蛋白質(zhì)在不同條件下高級結(jié)構(gòu)HOS(High Order Structure)的穩(wěn)定性，如溫度、pH值、輔料成分及儲存時間等，以確定適宜的存儲和運輸條件。同時，監(jiān)管機構(gòu)如FDA、EMA等在授權(quán)生物藥使用批準(zhǔn)之前也要求廣泛的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)。因此，理解和確保治療性蛋白質(zhì)藥物的高級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性是生物制藥企業(yè)開發(fā)安全有效藥物的必要條件，研究人員需要在研發(fā)和生產(chǎn)的多個階段對蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性進(jìn)行分析和評估。

　　蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的常見分析方法

　　蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性分析通常會使用以下方法進(jìn)行研究：

　　生化方法

　　圓二色譜(CD，Circular Dichroism Spectroscopy)

　　差示掃描量熱法(DSC)

　　定量PCR(qPCR)技術(shù)(外源熒光DSF)

　　動態(tài)光散射(DLS)與靜態(tài)光散射(SLS)方法

　　差示掃描量熱法(DSC)法常常被做為蛋白質(zhì)穩(wěn)定性分析最重要的的解決方案，然而，由于對儲存于微孔板(如96或384孔板)上的大量樣品的快速分析需求，使得DSC在藥物篩選和早期開發(fā)中的應(yīng)用受到一定的限制。因此，DSF(內(nèi)源熒光法)已成為一種流行且具有成本效益的解決方案。

　　DSF(內(nèi)源熒光法)無需對待測樣品進(jìn)行任何標(biāo)記，也無需使用任何熒光探針，即可快速測量整塊樣品微孔板，并提供高通量數(shù)據(jù)以幫助樣品候選物和配方成分的篩選。

　　DSF法快速篩選大量樣品，大大提高了藥物篩選、成藥性分析的效率，分析結(jié)果與DSC技術(shù)互相正交驗證。對很多生物技術(shù)藥物而言，利用DSF方法做為快速大量篩選，使用DSC技術(shù)來正交驗證DSF的早篩結(jié)果，是藥物篩選和藥物開發(fā)的一個有效方案。

　　DSF在蛋白質(zhì)穩(wěn)定性分析領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用，包括但不限于以下幾個方面：

　　蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性檢測：大多數(shù)蛋白質(zhì)對溫度具有嚴(yán)格的要求，蛋白熱穩(wěn)定性的評估有助于蛋白功能的正常表達(dá)。DSF不僅可以高通量測定蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定參數(shù)，而且還能評估突變、pH、離子強度等因素對熱穩(wěn)定性的影響，并從中篩選出可以提高熱穩(wěn)定性的因素。

　　蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑、抑制劑的高通量篩選：通過對化合物配體庫進(jìn)行高通量篩選，獲得與蛋白樣品相結(jié)合的候選化合物，評估化合物對蛋白穩(wěn)定性的影響，從而篩選出蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑、抑制劑、輔助因子及分子伴侶。

　　蛋白質(zhì)作用機制研究：如蛋白-蛋白互作研究，新發(fā)現(xiàn)蛋白藥物的親和動力學(xué)分析，蛋白與配體、輔助因子、分子伴侶結(jié)合的熱穩(wěn)定性參數(shù)測試。

　　小分子化合物抑制機制研究：利用DSF可以進(jìn)行高通量、矩陣式的多種化合物檢測(化合物與一些已知的抑制劑、底物、產(chǎn)物或輔助因子等結(jié)合)，用于小分子化合物抑制劑的篩選及其藥理機制的研究。

　　蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究：蛋白質(zhì)結(jié)晶是研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的一個非常重要的手段，利用DSF可以高通量篩選蛋白質(zhì)的結(jié)晶條件。

　　DSF技術(shù)原理：

　　差示掃描熒光法(DSF)是一種經(jīng)濟(jì)高效且易于使用的生物物理技術(shù)，它通過檢測當(dāng)溫度升高或變性劑存在時熒光發(fā)射光譜的相應(yīng)變化來確定蛋白質(zhì)的變性轉(zhuǎn)變溫度(熱轉(zhuǎn)變溫度Tm值或化學(xué)變性Cm值)。

　　研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)分子中芳香環(huán)氨基酸在處于不同極性的微環(huán)境時(如疏水或親水環(huán)境中)，其被激發(fā)的內(nèi)源熒光的最大發(fā)射光譜會發(fā)生位移。蛋白質(zhì)中內(nèi)源熒光主要來自含芳香環(huán)氨基酸如色氨酸(Trp)，苯丙氨酸(Phe)和酪氨酸(Tyr)，其中以色氨酸內(nèi)源熒光強。

　　以色氨酸為例，在蛋白質(zhì)疏水的內(nèi)核微環(huán)境中，其內(nèi)源熒光最大發(fā)射波長在330nm左右，而在親水的極性微環(huán)境中，色氨酸的內(nèi)源熒光最大發(fā)射波長則出現(xiàn)在350nm左右。蛋白質(zhì)熱變性或者化學(xué)變性通常會導(dǎo)致色氨酸殘基周圍微環(huán)境的極性發(fā)生變化，使通常被包埋于蛋白質(zhì)疏水內(nèi)核的色氨酸逐漸暴露于親水的環(huán)境中，從而導(dǎo)致內(nèi)源熒光最大發(fā)射波長發(fā)生紅移(Red Shift)，即向更大的波長區(qū)域移動。

　　這種監(jiān)測色氨酸內(nèi)源熒光變化的方法無需熒光探針或者標(biāo)簽，避免了傳統(tǒng)外源熒光DSF中背景熒光以及非特異吸附等假陽性結(jié)果。

　　當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)由于熱變性或者化學(xué)變性劑(如鹽酸胍、尿素等)作用而發(fā)生去折疊時，測量內(nèi)源熒光隨溫度或者變性劑的變化來就可以研究蛋白質(zhì)的展開過程。這些變化的數(shù)據(jù)可以用于生成熔解曲線，并獲取表觀熱轉(zhuǎn)變溫度Tm值、Tonset、范德華焓變(ΔH)、吉布斯自由能(ΔG)、化學(xué)變性Cm值等用于蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的評估和預(yù)測。

　　傳統(tǒng)DSF經(jīng)常使用350/330比值法來進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，而SUPR-DSF提供了多種分析方法，除了比值法外，SUPR-DSF還提供了BCM(Barycentric mean,質(zhì)心均值法)，可以得到比350/330比值法更好的信噪比，同時更有利于低濃度蛋白樣品的分析。

高通量蛋白質(zhì)穩(wěn)定性分析DSF系統(tǒng)主要特點：

　　采用標(biāo)準(zhǔn)的384微孔板，無需特殊的耗材和毛細(xì)管

　　高通量篩選，一個升溫過程(60-80分鐘)內(nèi)可完成

　　單塊384微孔板的測試?yán)脙?nèi)源熒光，無需染料或標(biāo)簽，兼容常用生物體系UV LED激發(fā)配合全光譜檢測

　　僅需要10-30μl樣品，樣品濃度0.05~250mg/mL

　　獲得關(guān)鍵參數(shù)：Tonset、Tm、ΔΗ、ΔG、Cm及親和力等

　　提供嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臄?shù)據(jù)質(zhì)量和可重復(fù)性

SUPR-DSF系統(tǒng)的應(yīng)用：

　　SUPR-DSF系統(tǒng)廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)基礎(chǔ)研究和藥物研發(fā)等多個領(lǐng)域：

　　加速突變體的篩選

　　配方和預(yù)配方的篩選和優(yōu)化

　　蛋白結(jié)晶條件篩選

　　批間一致性評估

　　生物相似性評估

　　加速應(yīng)力和強制降解研究

　　結(jié)合誘導(dǎo)的構(gòu)象變化分析

　　翻譯后修飾評估

　　恒溫和化學(xué)穩(wěn)定性分析

高通量蛋白質(zhì)穩(wěn)定性分析DSF系統(tǒng)的技術(shù)規(guī)格：

典型應(yīng)用案例--加速突變體的篩選

　　使用SUPR-DSF對16個樣品進(jìn)行比較和篩選，其中包括1個野生型蛋白(WT)和15個單點突變體。在1.5小時內(nèi)，DSF儀器生成了48個樣本(每組3次重復(fù))的高質(zhì)量熔解曲線(相同時間內(nèi)最多可生成384孔的數(shù)據(jù))。用模型對數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，可獲取熔解溫度Tm值并對穩(wěn)定性進(jìn)行排序和篩選。

　　如圖1所示，與WT(藍(lán)色)相比，其中3個突變體(9、13和14)的熔解曲線左移，說明其蛋白穩(wěn)定性降低；余下12個突變體的穩(wěn)定性均有所提高。其中，突變體1、8和12的穩(wěn)定性提升最大。

　　圖2展示了幾個代表性樣本的熔解曲線，可以發(fā)現(xiàn)一些蛋白質(zhì)發(fā)生了單一熱轉(zhuǎn)變過程(WT蛋白與突變體7和8)，而另一些蛋白質(zhì)(突變體1和14)則清楚地顯示出兩段熱轉(zhuǎn)變過程，即熔解曲線上有兩個拐點。通過SUPR-DSF提供的數(shù)據(jù)，可以幫助研究者篩選出有前景的候選物進(jìn)行深入研究。

精確解析單抗的Fab區(qū)域

　　使用SUPR-DSF獲得NISTmAb(NIST單抗標(biāo)準(zhǔn)品)的差示掃描熒光數(shù)據(jù)，并將結(jié)果與差示掃描量熱法(DSC)所獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。SUPR-DSF可以解析NISTmAb所有的三個結(jié)構(gòu)域:CH2(69°C)，CH3(83°C)，和Fab區(qū)域(94°C)。SUPR-DSF的最高掃描溫度為105°C，可以精確測量異常穩(wěn)定的Fab區(qū)域熔解溫度，而其他DSF平臺的掃描最高溫度一般僅為95°C，容易丟失單抗Fab區(qū)域去折疊變性的重要信息(圖5(a))。

　　將SUPR-DSF歸一化后的數(shù)據(jù)與DSC結(jié)果進(jìn)行比較。如圖5(b)所示，三個峰相互匹配，證明了兩種技術(shù)良好的一致性，使用SUPR-DSF可以輕松獲得高質(zhì)量的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性信息。

典型應(yīng)用案例--加速曲妥珠單抗的輔料和配方篩選

　　生物治療藥物如抗體等的配方是保證藥效、生產(chǎn)可行性和安全性的基礎(chǔ)，也決定了儲存和運輸?shù)臈l件。制藥企業(yè)亟需高通量的方法來快速可靠地篩選大量的條件組合，以確定最佳配方。

　　使用SUPR-DSF，研究者對治療性抗體曲妥珠單抗在96種不同條件下的穩(wěn)定性進(jìn)行了篩選和分析，并在1.5小時內(nèi)完成了測試。測試結(jié)果與差示掃描量熱法(DSC)的結(jié)果非常一致。如果集成實驗室自動化設(shè)備，每天可以完成數(shù)千個樣品的篩選。

　　DSF熔解曲線顯示出兩個獨立的轉(zhuǎn)變區(qū)域，通過最小二乘法對數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，可以確定Tonset值、Tm值和范德華焓變(△H)。圖3(a,b)分別展示了破壞/增強穩(wěn)定性的輔料的熔解曲線及擬合圖。圖4(a)列出了能夠提高抗體穩(wěn)定性的所有輔料(與對照樣品相比)。

　　SUPR-DSF正確鑒別了已上市的曲妥珠單抗中使用的輔料組氨酸和海藻糖的穩(wěn)定性作用，如圖4(b)所示，SUPRDSF數(shù)據(jù)具有出色的可靠性和一致性，同時提供驚人的高通量。

利用高通量差示掃描熒光法獲得結(jié)合參數(shù)

　　結(jié)合分析研究是藥物研發(fā)的一個關(guān)鍵領(lǐng)域，相互作用的特征和KD值(解離平衡常數(shù)，表征分子間結(jié)合的親和力)對候選物的選擇是至關(guān)重要的，研究者需要采用多種原理互補的方法來篩選和確定文庫中的數(shù)千種至數(shù)萬種小分子化合物。

　　通過SUPR-DSF進(jìn)行分子相互作用分析，不受表面效應(yīng)、物質(zhì)遷移(mass transport)或緩沖液折光率問題等因素的影響，可在分析物結(jié)合濃度范圍內(nèi)提供高通量、無需標(biāo)記的測量。

　　通過檢測蛋白質(zhì)-配體復(fù)合物的穩(wěn)定性變化，可用于確認(rèn)結(jié)合的特異性；通過熱變性時熒光發(fā)射光譜的變化和配體濃度的函數(shù)關(guān)系可以計算KD值。即使對于非常弱的結(jié)合分子，結(jié)合所誘導(dǎo)的穩(wěn)定性變化也能被SUPR-DSF檢測到。

　　使用標(biāo)準(zhǔn)384微孔板，能夠在一天內(nèi)篩選數(shù)千個樣品的穩(wěn)定性，從而確認(rèn)結(jié)合狀態(tài)。

　　使用SUPR-DSF研究配體(TFMSA)與人碳酸酐酶I的結(jié)合作用，碳酸酐酶隨TFMSA濃度變化的熔解曲線如圖6所示。