Green Retrobeads™ IX 試劑

原裝可靠的熒光示蹤劑，不要被其他供應(yīng)商未經(jīng)證實(shí)的說法所誤導(dǎo)！對(duì)于可靠，穩(wěn)健的逆行運(yùn)輸，只有一個(gè)選擇：來自Lumafluor的RetroBeads™。

無論他們?nèi)绾畏Q呼他們的產(chǎn)品，只有來自Lumafluor的Retrobeads™（普通和IX）已被數(shù)百篇已發(fā)表的論文證明是有效的，

范圍從無脊椎動(dòng)物到靈長類動(dòng)物，以及介于兩者之間的所有系統(tǒng)。

Lumafluor Retrobeads™:

高度受限注射——非常適合詳細(xì)的連接性研究。在活細(xì)胞中無限期存在（10 ~ 10年！），無毒。

與大多數(shù)其他順行示蹤劑、原位雜交和免疫組織化學(xué)相容。

將生物活性藥物（如神經(jīng)營養(yǎng)因子和神經(jīng)遞質(zhì)激動(dòng)劑/拮抗劑）遞送到局部區(qū)域；逆行轉(zhuǎn)運(yùn)可以確定哪些神經(jīng)元暴露于藥物[Riddle等人]。

是專門為促進(jìn)蛋白質(zhì)和其他生物活性化合物的吸附而制備的。

靈長類動(dòng)物系統(tǒng)中的示蹤劑是否比標(biāo)準(zhǔn)系統(tǒng)更有效

經(jīng)過驗(yàn)證的結(jié)果

來自Lumafluor的RetroBeads™是用于逆行追蹤的原始微球，也是在您的實(shí)驗(yàn)中被證明有效的微球。

綠色和紅色熒光RetroBeads™由Lumafluor提供，使用熒光乳膠微球或“珠子”作為逆行神經(jīng)元示蹤劑的大多數(shù)程序。

Green Retrobeads™ IX 試劑

供應(yīng)方式：所附小瓶中含有懸浮在蒸餾水中的微珠濃縮溶液。如果紅珠用于神經(jīng)元通路的逆行追蹤，溶液可以原樣使用，也可以稀釋。

在大鼠視覺皮層中，當(dāng)使用紅珠時(shí)，1:4的稀釋度似乎不會(huì)降低逆行標(biāo)記的質(zhì)量或程度。

但是，對(duì)于初始實(shí)驗(yàn)，我們強(qiáng)烈建議使用全強(qiáng)度溶液。除蒸餾水外，標(biāo)準(zhǔn)鹽溶液（NaCl, KCl）也可用作稀釋劑。

所提供的綠色珠子為逆行示蹤實(shí)驗(yàn)做好了準(zhǔn)備。不建議稀釋綠色珠子。

儲(chǔ)存：頭溶液應(yīng)儲(chǔ)存在加濕的容器中，在冰箱中，以防止蒸發(fā)。不要凍僵！被凍住的珠子不會(huì)起作用，也無法獲救。

如果珠子變干了，它們就不能再合成了。這種材料沒有保質(zhì)期，但是，如果儲(chǔ)存得當(dāng)，它可以保存好幾年。

應(yīng)用：珠子最好使用壓力注射（例如1毫升漢密爾頓注射器，或加壓空氣注射系統(tǒng)）。

對(duì)于局部電路工作，通過直徑為30-50微米的玻璃移液管注入非常小的體積（30-50毫升）。

對(duì)于常規(guī)逆行示蹤，使用更大的體積（0.1-0.3 ul）和更大直徑的移液頭。

然而，即使注射量大，珠粒也不會(huì)擴(kuò)散到遠(yuǎn)離注射部位（通常小于1mm）。

因此，為了標(biāo)記所有或大部分投射到一個(gè)大結(jié)構(gòu)的神經(jīng)元，需要進(jìn)行多次注射。

不建議使用離子電泳珠作為遞送示蹤劑的有效手段。然而，這些珠子確實(shí)帶一個(gè)凈負(fù)電荷。

存活時(shí)間：在大多數(shù)溫血脊椎動(dòng)物系統(tǒng)中，注射后的最小有效存活時(shí)間約為24小時(shí)。標(biāo)記強(qiáng)度隨著生存時(shí)間的延長而增加，可達(dá)48小時(shí)。

48小時(shí)后，沒有觀察到標(biāo)記強(qiáng)度的增加（或減少）。這些值在冷血?jiǎng)游镏锌赡苡泻艽蟮牟煌ㄗh初始存活時(shí)間為一周。

最長生存時(shí)間尚未確定，但即使在14個(gè)月的生存時(shí)間后，標(biāo)簽的質(zhì)量或范圍仍未改變。細(xì)胞可能被標(biāo)記。沒有觀察到對(duì)動(dòng)物或神經(jīng)元的毒性作用。

固定和處理：標(biāo)準(zhǔn)固定是0.1 M磷酸鹽緩沖液洗滌，然后在0.1 M磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）中加入4%多聚甲醛。

戊二醛會(huì)產(chǎn)生大量的組織自身熒光，這可能會(huì)模糊頭部標(biāo)記的神經(jīng)元，如果可能的話應(yīng)該避免。綠珠在戊二醛固定材料中不可見。

冷凍切片收集在磷酸鹽緩沖液中，安裝在涂有明膠的載玻片上，風(fēng)干。干燥后，載玻片可在二甲苯中清除1分鐘，并蓋上Fluoromount或Krystalon。

Fluoromount可從紐約州Farmingdale的Atomergic chemicals Corp.獲得；來自新澤西州吉布斯敦Harleco （EM Industries）的Krystalon。

短暫接觸酒精和二甲苯是無害的，但長時(shí)間接觸（超過5分鐘）會(huì)破壞珠子。珠子對(duì)甘油非常敏感，如果安裝在含甘油的溶液中，會(huì)迅速褪色。

在需要使用性清除/安裝劑的情況下，水楊酸甲酯優(yōu)于甘油。如果在黑暗中保存載玻片，細(xì)胞中的標(biāo)記至少在一年內(nèi)不會(huì)褪色

（盡管背景自身熒光可能會(huì)顯著增加）。到目前為止，在塑料植入后保留頭部標(biāo)簽的嘗試還沒有成功。

觀察：紅色珠子中的染料是羅丹明，因此任何羅丹明的熒光濾光片都可以使用。一些舊的尼康羅丹明濾鏡組提供非常高的背景，

這可以使標(biāo)記的細(xì)胞不可見。蔡司和雷茲標(biāo)準(zhǔn)羅丹明濾光片均取得了良好的效果。對(duì)于綠色珠子，寬帶熒光素過濾器效果很好。

為路西法黃色設(shè)置的過濾器會(huì)產(chǎn)生更強(qiáng)烈的信號(hào)，但代價(jià)是更高的背景。窄帶熒光素濾光片比寬帶濾光片發(fā)出的信號(hào)要弱得多。

即使經(jīng)過長時(shí)間的觀察或顯微攝影，珠子也不會(huì)明顯褪色。

在低倍率、低數(shù)值孔徑干物鏡（如X4、X10）下，通常看不到標(biāo)簽。如果細(xì)胞被強(qiáng)烈標(biāo)記，X10的浸沒物鏡（數(shù)值孔徑為0.4或更大），

或更高倍率的干物鏡，通常會(huì)顯示細(xì)胞。然而，X25浸入式物鏡經(jīng)常會(huì)顯示出低倍率物鏡看不到的非常清晰的標(biāo)記細(xì)胞。

這些警告對(duì)于綠色珠子尤其適用。在確定實(shí)驗(yàn)無效之前，用浸泡物鏡檢查注射部位附近的切片。可見大量的局部標(biāo)記細(xì)胞。

對(duì)于綠色珠子使用者的額外信息：在目前所做的工作中，似乎年輕的動(dòng)物比年長的動(dòng)物更容易運(yùn)輸標(biāo)簽。此外，年輕動(dòng)物的組織自身熒光較低。

因此，如果可能的話，在涉及綠珠的實(shí)驗(yàn)中，建議使用年輕的動(dòng)物。

因?yàn)榫G色珠子比紅色珠子在更短的波長下被激發(fā)，組織自身熒光是一個(gè)更大的問題。因此，努力減少自身熒光將產(chǎn)生更好的對(duì)比信號(hào)。

減少自身熒光的方法包括：

1)使用更薄的切片（例如30微米而不是40或50微米）；2)使用更年輕的動(dòng)物，3)在封面滑落后立即檢查部分（背景隨著時(shí)間的推移而增加）。