ECL化學發(fā)光底物（超敏）

產(chǎn)品簡介：

 ECL超敏發(fā)光液用于檢測直接或間接標記辣根過氧化物酶HRP的抗體及其關聯(lián)的抗原。

產(chǎn)品組份：

用途：用于HRP標記抗體的Western Blot和HRP標記探針的核酸雜交。

產(chǎn)品特點：

1、靈敏度高：可檢測低皮克級的蛋白；

2、信號持續(xù)時間長：光信號持續(xù)時間長達5小時；

3、穩(wěn)定試劑：工作液在24小時內保持穩(wěn)定；

4、成像方法：適用于CCD或激光凝膠成像儀；

5、價格經(jīng)濟：針對稀釋的抗體濃度條件進行了優(yōu)化，節(jié)省抗體：

一抗：以1 µg/mL儲存液稀釋1:1,000至1:4,000倍

二抗：以1 µg/mL儲存液稀釋1:2,000至1:5,000倍

6、簡單易用：可替代其它公司的ECL發(fā)光底物，操作步驟無需進行特別優(yōu)化；

使用方法:

1、執(zhí)行常規(guī)SDS-PAGE、轉膜和Western Blot步驟。注意用HRP標記IgG或用一抗-鏈親和素-生物/素-HRP夾法。

2、 Western Blot最后一次洗膜的同時新鮮配制發(fā)光工作液：分別取等體積的溶液A和B，放入干凈容器中混合。建議立即使用工作液，室溫放置數(shù)小時后仍可使用但靈敏度略有降低。

3、 用鑷子取出膜，搭在濾紙上瀝干洗液但勿使膜干燥。將膜浸入發(fā)光工作液（0.125mL發(fā)光工作液/cm2膜）中，與發(fā)光工作液充分接觸。室溫孵育3分鐘，準備立即壓片曝光。孵育時間過長不會增加靈敏度，有時還會導致曝光條帶異常。發(fā)光過程的本質是酶促反應，使用過少的發(fā)光工作液不利反應進行，也會導致膜上條帶曝光不均和明顯降低靈敏度。為達節(jié)約目的可將膜剪小但勿降低發(fā)光液用量。

4、 用鑷子夾起膜，搭在濾紙上瀝干發(fā)光工作液。但勿洗去發(fā)光液。

5、 打開X光膠片暗盒，在暗盒內表面鋪一張面積大于膜的保鮮膜。將Western Blot膜貼在保鮮膜上，將保鮮膜折起來包裹Western Blot膜，去除氣泡和皺褶，可剪去邊緣部多余的保鮮膜。用濾紙吸去多余的發(fā)光工作液。用膠帶將覆蓋Western Blot膜的保鮮膜固定在暗盒內，蛋白帶面向上。

6、 暗房內壓X光膠片，分別曝光不同的時間，如數(shù)秒到數(shù)分鐘。顯影沖洗。建議第一次曝光 60 秒，之后可調整曝光時間以達到最佳結果。化學發(fā)光反應在底物孵育后的前 5-30 min期間是強烈的。這一反應可以持續(xù)幾個小時，但強度會隨時間下降，如有底物孵育后較長時間后曝光，曝光時間可能需要延長以獲得較強信號。          

注意事項：

（1）步驟1～5可在日光燈下操作；但發(fā)光液曝露于強光下時間過久靈敏度可能略有降低，移到暗房操作可避免之。

（2）長時間曝光或蛋白過量，將加深背景并使條帶強弱變化失去線性關系。曝光不足則條帶模糊。

（3）發(fā)光工作液孵育約3分鐘后膜上的條帶發(fā)光。強條帶發(fā)光在暗房中肉眼可見，低豐度蛋白條帶發(fā)光較弱甚至肉眼不可見但可使X光膠片曝光。肉眼不可見的熒光實際上可持續(xù)數(shù)小時并使X光膠片感光，因而弱帶可曝光1-10小時。如果曝光后條帶不佳，可用洗膜緩沖液洗膜，重新孵育二抗，然后重新用ECL發(fā)光和曝光。

（4）由于超敏發(fā)光液極其靈敏，建議按照推薦比例稀釋抗體。抗體濃度過高將造成高背景或沒有條帶，導致失敗。

（5）某些保鮮膜包裹印跡膜時可能會淬滅熒光，應選擇高質量保鮮膜。

（6）使用肉眼可見的預染色蛋白Marker和熒光-放射自顯影曝光標簽可精確確定膠片上條帶的位置和大小。

（7）疊氮鈉是 HRP 的抑制物，不要使用疊氮鈉作為緩沖液的防腐劑。

問題解答：

*為檢測系統(tǒng)活性，在暗室中，在一個清潔試管中制備1-2ml工作液。關閉燈，添加1ul未稀釋的HRP標記二抗工作液。該溶液應當立即發(fā)出藍色光，藍光信號在隨后的幾分鐘漸淡。

AMEKO試劑：超敏ECL化學發(fā)光底物

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