PANC-1/GEM 人胰腺癌細胞吉西他濱耐藥株 百歐博偉生物

PANC-1/GEM 人胰腺癌細胞吉西他濱耐藥株 百歐博偉生物

一、細胞簡介

平臺編號：bio-106238

規(guī)格：1*10E6

拉丁屬名：PANC-1/GEM 人胰腺癌細胞吉西他濱耐藥株

中文名稱：人胰腺癌細胞吉西他濱耐藥株

細胞用途：僅供科研使用

注意事項：僅用于科學研究或者工業(yè)應用等非醫(yī)療目的，不可用于人類或動物的臨床診斷或治療，非藥用，非食用

二、細胞描述

該人胰腺癌細胞PANC-1來源于一名56歲白人男性。1 U/ml 左旋天冬酰胺酶(L-asparaginase)可抑制其生長。此細胞可以在瓊脂糖上生長。

三、細胞特性

1）來源：胰腺，胰管，上皮細胞癌

2）形態(tài)：上皮細胞樣，貼壁生長

3）含量：>1x106

4）污染：支原體、細菌、酵母和真菌檢測為陰性

5）規(guī)格：T25瓶或者1mL凍存管包裝

四、細胞誘導構建實驗步驟

1、MTT 法檢測 PANC-1 對吉西他濱的 IC50將處于對數(shù)生長期的 PANC-1 細胞傳代后，以 6000/孔的密度接種在 96 孔板里，待細胞生長穩(wěn)定后，將培養(yǎng)基更換為含不同濃度吉西他濱的培養(yǎng)基，濃度依次為 0.03μg/mL、0.3μg/mL、1.5μg/mL、3μg/mL、6μg/mL、12μg/mL、18μg/mL。置于含 5%CO2、飽和濕度的 37℃恒溫細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 72h。取出 96孔板，每孔加入 20ul MTT（5 mg/mL）溶液加入到每個培養(yǎng)孔中，繼續(xù)培養(yǎng) 4 h。4 h 后，取出 96 孔板，吸除培養(yǎng)基，排槍每孔加入 150 µL Formazan 溶液，置搖床上低速振蕩 10-30min，使結晶物充分溶解。使用酶標儀在 OD 570nm 處測量各孔的吸光值，分析實驗結果，得出 IC50 為 0.9μg/mL，則選擇此濃度作為 PANC-1耐藥株誘導的起始濃度。

2、PANC-1 細胞耐藥分步誘導取處于對數(shù)生長期的 PANC-1 細胞，加入含 0.9μg/mL 吉西他濱的培養(yǎng)基，置于含 5%CO2、飽和濕度的 37℃恒溫細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。隔日換液（同濃度含藥培養(yǎng)基），待細胞可以穩(wěn)定生長后加大藥物濃度，每次增加 2 倍，直至 10 個月后，細胞可以在含 18μg/mL 吉西他濱的培養(yǎng)基保持穩(wěn)定生長 4day，視為細胞耐藥成功，并命名為 PANC-1/GEM。

五、細胞的運輸和保存

可選擇干冰運輸及發(fā)送復蘇存活細胞方式

（1）干冰運輸，收到后立即轉入液氮凍存或直接復蘇；

（2）存活細胞，收到后應繼續(xù)生長，傳代達到細胞生長狀態(tài)良好時，再進行凍存。具體操作見細胞培養(yǎng)步驟。

六、注意事項

1、收到細胞后，若發(fā)現(xiàn)干冰已揮發(fā)干凈、凍存管瓶蓋脫落、破損及細胞有污染，請立即與我們聯(lián)系。

2、收到細胞先不開瓶蓋，瓶身擦拭酒精后放在培養(yǎng)箱靜置2-4小時（視細胞密度而定）穩(wěn)定細胞狀態(tài)。接著在倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況，并對細胞進行不同倍數(shù)拍照（建議收細胞時就整體外觀拍一張照片，觀察培養(yǎng)基的顏色和是否有漏液情況，隨后在顯微鏡下拍下細胞狀態(tài)，100*，200*各一張），觀察記錄細胞在運輸過程中是否有污染情況。作為我方進行銷售依據。

3、由于細胞狀態(tài)受環(huán)境、操作和運輸?shù)榷喾矫嬉蛩赜绊懀时竟局槐ＷC客戶收到細胞后一周內的細胞狀態(tài)，故客戶需要售后時需出示收到細胞的時間證明及客戶提供收貨時間和發(fā)現(xiàn)問題后客服人員溝通的時間證明，期間間隔時間不能大于7天。

4、所有動物細胞均視為有潛在的生物危害性，必須在二級生物安全臺內操作，并請注意防護，所有廢液及接觸過此細胞的器皿需要滅菌后方能丟棄。

七、細胞接收后的處理方法

1）收到細胞后，請檢查發(fā)貨培養(yǎng)瓶的狀況，若發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)瓶破損、有液溢出及細胞有污染，請拍照后及時聯(lián)系我們。

2）在顯微鏡下確認細胞生長狀態(tài)時，在低倍鏡（4或5X物鏡)下進行，能準確判斷細胞的傳代密度。看細胞的形態(tài)請在10X和20×物鏡下，同時給剛收到的細胞拍照，（10×，20×）各2-3張以及培養(yǎng)瓶外觀照片一張留存，作為細胞需要售后時提供收到細胞時細胞狀態(tài)的依據。

3）觀察好細胞狀態(tài)后，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱放置約2-3h。

4）貼壁細胞：在運輸過程中貼壁細胞會有脫落的現(xiàn)象，如發(fā)現(xiàn)貼壁細胞有脫落或者脫落后抱團生長，可將T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱放置約2-3h，然后抽出瓶中的培養(yǎng)基和未貼壁細胞1000rpm離心5分鐘，棄去上清重懸后接種到加有按照說明書細胞培養(yǎng)條件新配制的培養(yǎng)基的原培養(yǎng)瓶中（或新的培養(yǎng)瓶中）。

5）懸浮細胞：T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱放置約2-3h，然后抽出瓶中的培養(yǎng)基和細胞1000rpm離心5分鐘，棄去上清重懸后接種到新的培養(yǎng)瓶中（加入按照說明書細胞培養(yǎng)條件新配制的培養(yǎng)基）。

6）備注：運輸用的培養(yǎng)基（灌液培養(yǎng)基）不能再用來培養(yǎng)細胞，請換用按照說明書細胞培養(yǎng)條件新配制的培養(yǎng)基來培養(yǎng)細胞。收到細胞后次傳代建議1：2傳代。                 

八、細胞培養(yǎng)步驟

1、培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準備：

1）準備DMEM培養(yǎng)基（含NaHCO3 1.5g/L；GIBCO,貨號12800017，添加NaHCO3 1.5g/L)；優(yōu)質胎牛血清，10%；L-glutamine(推薦gibco貨號：35050-061)，2mM；雙抗，1%；（可在培養(yǎng)基中加入耐藥濃度18ug/ml的GEM)

2）細胞在傳代和剛復蘇時較為脆弱，中止液須為不含GEM的培養(yǎng)基，且在細胞未貼壁期間和貼壁前期需用不含GEM的培養(yǎng)基，待細胞生長狀態(tài)穩(wěn)定時再根據需要濃度添加 GEM。

3）若細胞生長狀態(tài)較為緩慢時，可適當降低GEM的濃度，或使用不含GEM的培養(yǎng)基培養(yǎng)至細胞生長狀態(tài)較好時，再更換為所需的GEM濃度。

4）培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

5）凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。

2、細胞處理：

1）復蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或將細胞懸液加入10cm皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細胞密度。

2）細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。

①棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。

②加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

③按6-8ml/瓶補加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。

④將細胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

3）細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時，可進行細胞凍存。貼壁細胞凍存時，棄去培養(yǎng)基后加入少量，細胞變圓脫落后，加入約1ml含血清的培養(yǎng)基后加入凍存管中，再添加10%DMSO后進行凍存。

下面T25瓶為例；

1、細胞凍存時，棄去培養(yǎng)基后，PBS清洗瓶底1-2次后加入1ml，細胞變圓脫落后，加入2ml培養(yǎng)基終止消化，可使用血球計數(shù)板計數(shù)。

2、1000RPM離心5分鐘去掉上清。用血清重懸浮，加DMSO至最終濃度為10%。加入DMSO后迅速混勻，按每1ml的數(shù)量分配到凍存管中，注意凍存管做好標識。本公司按每個凍存管細胞數(shù)目大于1X106個細胞凍存。

3、將凍存管置于程序降溫盒中，放入-80度冰箱，至少2個小時以后轉入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。