高保真基因文庫(kù)制備儀

高分辨率基因敲除驗(yàn)證-Samplix單細(xì)胞分析：一種高通量單細(xì)胞、單分子、納米顆粒乳化液滴封裝與分選系統(tǒng)

wei yi 可實(shí)現(xiàn)單分子、細(xì)胞、細(xì)胞器、納米顆粒封裝和高吞吐量分選。 DNA封裝使得能夠以qian suo wei you 的速度篩選大型復(fù)雜的基因庫(kù)。

Xdrop制備型

高分辨率基因敲除驗(yàn)證-Samplix單細(xì)胞分析是一種多功能且用戶友好的儀器，用于制備活的哺乳動(dòng)物或微生物細(xì)胞、細(xì)胞器、DNA 或其他生物材料以進(jìn)行高分辨率下游分析。

使用我們的Xdrop 試劑盒，Xdrop 安全快速地將活細(xì)胞、細(xì)胞器或 DNA 片段連同測(cè)定化學(xué)物質(zhì)一起封裝在高度穩(wěn)定的皮升體積雙乳化液滴中。這些液滴通過(guò)移液、渦旋、孵育、流式細(xì)胞術(shù)、分選，甚至長(zhǎng)期儲(chǔ)存都很穩(wěn)定。更重要的是，可以從液滴中回收細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增。

與適當(dāng)?shù)姆治黾夹g(shù)一起，Xdrop 應(yīng)用包括：

1     人體免疫細(xì)胞、NK細(xì)胞

2     微生物細(xì)胞的酶分泌

3     哺乳動(dòng)物細(xì)胞分泌細(xì)胞因子

4      驗(yàn)證基因編輯，包括評(píng)估意外的在靶和脫靶重排

借助 Xdrop，研究人員可以更輕松地深入了解人類(lèi)、動(dòng)物、植物和微生物的細(xì)胞功能和基因組學(xué)。Xdrop 還可以為其他工作流程生成單乳液液滴，包括封裝 DNA 以進(jìn)行無(wú)偏差的全基因組擴(kuò)增。 我們提供 Xdrop 所需的全套試劑、試劑盒和附件。此外，用戶培訓(xùn)是我們標(biāo)準(zhǔn) Xdrop 安裝服務(wù)的一部分。

優(yōu)勢(shì)

1      Xdrop 可以將活的哺乳動(dòng)物或微生物細(xì)胞包裹在高度穩(wěn)定的雙乳液滴中，用于功能測(cè)定、孵育、表型分析和篩選。

2      Xdrop 幫助 回答工程細(xì)胞和基因治療研究中的關(guān)鍵問(wèn)題。

3      Xdrop 支持分子工程工作流程，包括酶進(jìn)化和途徑工程。

4      Xdrop 具有用戶友好的界面和較小的占地面積，使每個(gè)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室都能使用微流體的強(qiáng)大功能。

雙層乳化試劑盒

所有試劑都包含在試劑盒內(nèi)，每次操作能封裝數(shù)百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞或分子。

Xdrop Sort制備分選型

這個(gè) Xdrop 家族的新成員可以在用戶友好的工作流程中生成和分選雙乳液液滴，不需要任何基于熒光的細(xì)胞分選的經(jīng)驗(yàn)。

工作流程從高度穩(wěn)定的液滴中捕獲 100 kb DNA 片段、小單細(xì)胞或其他生物材料開(kāi)始，用于 PCR 和酶活性評(píng)估等測(cè)定。然后，根據(jù)液滴內(nèi)包含物熒光，對(duì)液滴進(jìn)行分選，以僅獲取感興趣的樣品以進(jìn)行高分辨率下游分析，例如：

驗(yàn)證沒(méi)有隱藏意外重排的 PCR 偏差的 CRISPR 編輯

識(shí)別病毒和轉(zhuǎn)基因整合位點(diǎn)

在單細(xì)胞水平評(píng)估酶活性

執(zhí)行高通量 GFP 篩選

優(yōu)勢(shì)：

·      能夠有針對(duì)性地富集長(zhǎng)片段

·      高靈敏度 - 單分子檢測(cè)

·      保持DNA的內(nèi)在性

·      幾乎不需要先驗(yàn)序列知識(shí)

·      兼容PacBio、Nanopore和Illumina測(cè)序

·      通過(guò)自動(dòng)微流體系統(tǒng)輕松設(shè)置

·      將周轉(zhuǎn)時(shí)間從數(shù)周縮短到數(shù)天

應(yīng)用：

·      結(jié)構(gòu)變化

·      復(fù)雜樣本（例如癌癥活檢）

·      難以測(cè)序的區(qū)域（例如富含GC）

·      基因組間隙閉合

·      基因定相/基因分型/單倍體分型

·      將抗性基因與宿主聯(lián)系起來(lái)

·      低豐度區(qū)域的測(cè)序

·      重復(fù)區(qū)域的評(píng)估

·      僅含有納克 DNA 的樣品

輔助材料

1、DE50 墨盒-用于將哺乳動(dòng)物細(xì)胞包裹在雙乳液滴中

產(chǎn)生高度穩(wěn)定的 ~100 皮升雙乳液滴，以封裝哺乳動(dòng)物細(xì)胞，將大細(xì)胞轉(zhuǎn)化為單細(xì)胞檢測(cè)。使用 Xdrop DE50 Cartridge 的工作流程包括細(xì)胞因子分泌和細(xì)胞殺傷測(cè)定。只需加載試劑和樣品，將試劑盒放入 Xdrop，然后運(yùn)行程序。

同時(shí)或單獨(dú)運(yùn)行 8 個(gè)樣品

在 8 分鐘內(nèi)每條泳道產(chǎn)生多達(dá) 500,000 個(gè)液滴在 CO 2培養(yǎng)箱中用細(xì)胞孵育液滴

恢復(fù)選定的單元格進(jìn)行擴(kuò)展

2、DE20 墨盒-用于將微生物細(xì)胞、細(xì)胞器或 DNA 長(zhǎng)片段包裹在雙乳液滴中

使用獨(dú)立的 Xdrop DE20 小柱產(chǎn)生高度穩(wěn)定的約 1.5 皮升的雙乳化液滴，以封裝數(shù)百萬(wàn)個(gè)微生物細(xì)胞、細(xì)胞器或 DNA。每個(gè)液滴充當(dāng)單細(xì)胞分辨率測(cè)定或 DNA 靶向富集的隔室。只需加載試劑和樣品，將試劑盒放入 Xdrop 或 Xdrop Sort，然后運(yùn)行程序。

同時(shí)或單獨(dú)運(yùn)行 8 個(gè)樣品

在 45 分鐘內(nèi)每條泳道產(chǎn)生多達(dá) 1000 萬(wàn)個(gè)液滴在 CO 2培養(yǎng)箱中用細(xì)胞孵育液滴

恢復(fù)選定的單元格進(jìn)行擴(kuò)展確保無(wú)污染的工作流程

3、DE20 分選盒-用于分選含有 DNA 或小細(xì)胞的雙乳液滴

使用新型 Xdrop DE20 分選盒分選含有熒光 DNA 或小細(xì)胞的雙乳化液滴。這個(gè)用戶友好的系統(tǒng)專(zhuān)為與我們的新儀器 Xdrop Sort 一起使用而設(shè)計(jì)，不需要熒光分選儀方面的專(zhuān)業(yè)知識(shí)。只需加載試劑和樣品，將試劑盒放入 Xdrop Sort，然后運(yùn)行分選程序。

同時(shí)運(yùn)行多達(dá) 8 個(gè)樣品每天分揀數(shù)十億個(gè)液滴確保無(wú)污染的工作流程

4、SE85 墨盒-用于將 DNA、RNA、細(xì)胞器或小細(xì)胞包裹在單乳液液滴中

使用獨(dú)立的 Xdrop SE85 墨盒產(chǎn)生單乳液液滴以封裝數(shù)百萬(wàn)個(gè)分子、細(xì)胞器或細(xì)胞。每個(gè)液滴充當(dāng)單分子或單細(xì)胞分辨率測(cè)定的隔室。只需加載試劑和樣品，將試劑盒放入 Xdrop 或 Xdrop Sort，然后運(yùn)行程序。

同時(shí)或單獨(dú)運(yùn)行 8 個(gè)樣品

在 40 秒內(nèi)每條泳道產(chǎn)生超過(guò) 50,000 個(gè)液滴確保無(wú)污染的工作流程

應(yīng)用

Xdrop 使用的專(zhuān)有微流體技術(shù)來(lái)生成高度穩(wěn)定的雙乳化液和單乳化液滴，用于封裝生物材料。

這種多功能且用戶友好的儀器封裝了生命的組成部分，例如活的哺乳動(dòng)物和微生物細(xì)胞，或 DNA 長(zhǎng)片段，用于一系列下游目的，包括孵化、分析、分類(lèi)和分子譜分析。

Xdrop Sort 以 Xdrop 專(zhuān)有的微流體技術(shù)為基礎(chǔ)，增加了基于封裝生物材料的熒光分選雙乳液滴的能力。

以下是一些代表性的應(yīng)用。

細(xì)胞功能分析：

·      人體免疫細(xì)胞、NK細(xì)胞

·      微生物細(xì)胞的酶分泌

·      哺乳動(dòng)物細(xì)胞分泌細(xì)胞因子

基因組學(xué)應(yīng)用：

·      結(jié)構(gòu)變化

·      復(fù)雜樣本（例如癌癥活檢）

·      難以測(cè)序的區(qū)域（例如富含GC）

·      基因組間隙閉合

·      基因定相/基因分型/單倍體分型

·      將抗性基因與宿主聯(lián)系起來(lái)

·      低豐度區(qū)域的測(cè)序

·      重復(fù)區(qū)域的評(píng)估

·      僅含有納克 DNA 的樣品

植物基因組學(xué)應(yīng)用：

·      豐富了植物品種中的特定基因組區(qū)域

·      揭示沒(méi)有參考基因組的大麥品種中生物合成基因簇的結(jié)構(gòu)

·      填補(bǔ)番茄品種中生物合成基因簇結(jié)構(gòu)的空白

應(yīng)用實(shí)例：

1、全基因組的準(zhǔn)確擴(kuò)增

事實(shí)上，99%的靶基因組不止一次被文庫(kù)的測(cè)序讀取所覆蓋。

使用 Xdrop  dMDA 技術(shù)擴(kuò)增基因，即使在輸入量低至 1 pg 時(shí)也能保真準(zhǔn)確的擴(kuò)增全部基因。

2、基因定相Phasing

CYP2D6*7等位基因包含1個(gè)單核苷酸多態(tài)性（SNP），而CYP2D6*25A包含22個(gè)SNP。

Xdrop技術(shù)能夠準(zhǔn)確測(cè)出所有 23 種變體，包括Phasing（見(jiàn)下圖）。

Xdrop通過(guò)簡(jiǎn)單的設(shè)計(jì)和長(zhǎng)DNA片段（~100 kb）的間接序列捕獲為應(yīng)用提供支持。結(jié)合長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序，Xdrop克服了在單個(gè)遺傳異質(zhì)樣品中基因定相的困難。

富集的高保真度能夠檢測(cè)等位基因中的一個(gè)或多個(gè)SNP，并使從頭組裝能夠解決結(jié)構(gòu)變化。

3、監(jiān)測(cè)基因復(fù)雜的結(jié)構(gòu)變化

對(duì)跨越斷點(diǎn)的讀數(shù)的詳細(xì)分析顯示，在8號(hào)染色體上的區(qū)域中存在多個(gè)HPV18整合位點(diǎn)。PacBio、Oxford Nanopore和Illumina數(shù)據(jù)集支持已識(shí)別的整合位點(diǎn)。

Xdrop技術(shù)是一種新的靶向DNA富集方法，其 unique 之處在于可以選擇、富集和測(cè)序天然DNA片段。這允許富集大的基因組部分（約100kb），包括未知區(qū)域。使用Xdrop?方法生成的長(zhǎng)片段不僅適用于長(zhǎng)讀測(cè)序，還可以為短讀測(cè)序提供有價(jià)值的上下文信息。

4、對(duì)未知的感興趣區(qū)域（ROI）的測(cè)序

PCR和基于探針的靶向DNA富集方法需要密集的設(shè)計(jì)優(yōu)化和完整的感興趣區(qū)域（ROI）知識(shí)。這些傳統(tǒng)方法在表征復(fù)雜的基因組環(huán)境（例如重復(fù)區(qū)域、結(jié)構(gòu)變異、富含GC的區(qū)域）以及未知和重排的區(qū)域方面也失敗。為了克服這些限制，Samplix開(kāi)發(fā)了一種新的微流體方法，即基于間接序列捕獲的Xdrop富集工作流。

Xdrop可以富集需要在檢測(cè)序列上設(shè)計(jì)單個(gè)引物對(duì)的長(zhǎng)（~100 kb）靶DNA區(qū)域，對(duì)應(yīng)于ROI的一小部分或側(cè)翼區(qū)域。該擴(kuò)增子專(zhuān)門(mén)用于檢測(cè)、選擇和富集全長(zhǎng)ROI，終進(jìn)行捕獲和測(cè)序。

使用Xdrop?技術(shù)解決這些挑戰(zhàn)性區(qū)域的能力為解決許多其他挑戰(zhàn)性區(qū)域打開(kāi)了大門(mén)，這些區(qū)域可能代表了很大比例的基因組。將Xdrop富集與長(zhǎng)讀和短讀測(cè)序技術(shù)相結(jié)合，可以提供所需的高分辨率，以快速且經(jīng)濟(jì)的方式解決復(fù)雜的基因組場(chǎng)景，繞過(guò)全基因組測(cè)序。

5、識(shí)別和確認(rèn)CRISPR基因編輯操作

通過(guò)簡(jiǎn)單的設(shè)計(jì)和長(zhǎng)DNA片段的間接序列捕獲，Xdrop有助于識(shí)別通常難以找到且成本高昂的轉(zhuǎn)基因插入位點(diǎn)。

構(gòu)建體中的隨機(jī)整合和宿主基因組序列的存在使整合位點(diǎn)鑒定變得復(fù)雜。 Xdrop使驗(yàn)證基因組工程變得簡(jiǎn)單明了。

實(shí)驗(yàn)過(guò)程

1、混合 dPCR 試劑

將DNA添加到含有目標(biāo)特異性pri-mers的dPCR反應(yīng)混合物中。

2、片上液滴生產(chǎn)

反應(yīng)在液滴發(fā)生器芯片上分配，以生產(chǎn)水包水液（DE）液滴。

3、高分辨率微滴式聚合酶鏈反應(yīng)

液滴經(jīng)過(guò)熱循環(huán)，可并行運(yùn)行數(shù)百萬(wàn)個(gè)PCR-re操作。通過(guò)檢測(cè)熒光液滴，可以識(shí)別攜帶目標(biāo)DNA分子的液滴。

4、計(jì)數(shù)和分離液滴

檢測(cè)和分離使用細(xì)胞分選設(shè)備（FACS）完成，該分選儀可以收集含有靶DNA分子的PCR陽(yáng)性液滴

5、富集DNA的擴(kuò)增

長(zhǎng)DNA片段的富集單分子通過(guò)液滴多位移擴(kuò)增（dMDA）進(jìn)行擴(kuò)增，以確保無(wú)偏的DNA擴(kuò)增和對(duì)目標(biāo)區(qū)域的均勻覆蓋。

參考文獻(xiàn)

1.    Population-wide gene disruption in the murine lung epithelium via AAV-mediated delivery of CRISPR-Cas9 components Honglin Chen, Steffen Durinck, Hetal Patel, etc.

Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 2022. 27: 431–449; doi: 10.1016/j.omtm.2022.10.016.

2.    Target-enriched nanopore sequencing and de novo assembly reveals co-occurrences of complex on-target genomic rearrangements induced by CRISPR-Cas9 in human cells Keyi Geng, Lara G Merino, Linda Wedemann, etc.

Genome Res. 2022. 32(10): 1876–1891; doi: 10.1101/gr.276901.122

3.    Characterization of FMR1 repeat expansion and intragenic variants by indirect sequence capture Valentina Grosso, Luca Marcolungo, Simone Maestri,etc.

Front. Genet. 2021. 12: 743230; doi: 10.3389/fgene.2021.743230

4.    Generation and analysis of innovative genomically humanized knockin SOD1, TARDBP (TDP-43), and FUS mouse models Anny Devoy, Georgia Price, Francesca De Giorgio,etc.

iScience. 2021. 24(12): 103463; doi: 10.1016/j.isci.2021.103463

5.    CRISPR/Cas9 deletions induce adverse on-target genomic effects leading to functional DNA in human cells Keyi Geng, Lara Garcia Merino, Linda Wedemann, etc.

bioRxiv 2021.07.01.450727;

6.    Alt-RPL36 downregulates the PI3K-AKT-mTOR signaling pathway by interacting with TMEM24 Xiongwen Cao, Alexandra Khitun, Yang Luo, etc.

Nature Communications 12, 508, 2021. doi: 10.1038/s41467-020-20841-6

7.    Reconstruction of the birth of a male sex chromosome present in Atlantic herring Rafati N, Chen J, Herpin A, etc.

Proc Natl Acad Sci U S A. 2020 Sep 29;117(39):24359-24368. doi: 10.1073/pnas.2009925117. Epub 2020 Sep 16. PMID: 32938798.

8.    Verification of CRISPR editing and finding transgenic inserts by Xdrop Indirect sequence capture followed by short- and long- read sequencing Blondal Thorarinn, Gamba Cristina, Jagd Lea M?ller, etc.

Methods. 2021 Jul;191:68-77. doi: 10.1016/j.ymeth.2021.02.003. Epub 2021 Feb 12. PMID: 33582298.

9.    Xdrop: Targeted sequencing of long DNA molecules from low input samples using droplet sorting Madsen EB, H?ijer I, Kvist T, etc.

2020 Sep;41(9):1671-1679. doi: 10.1002/humu.24063. Epub 2020 Jun 29. PMID: 32516842; PMCID: PMC7496172.

10.   Cell-based Long-read whole genome analysis of human single cells Joanna H?rd, Jeff E Mold, Jesper Eisfeldt,etc.

2021bioRxiv 2021.04.13.439527;

11.   Corrigendum to "Generation of a set of isogenic, gene-edited iPSC lines homozygous for all main APOE variants and an APOE knock-out line Schmid B, Prehn KR, Nimsanor N, etc.

Stem Cell Res. 2020 Sep 21;48:102005. doi: 10.1016/j.scr.2020.102005. Epub ahead of print. Erratum for: Stem Cell Res. 2019 Jan;34:101349. PMID: 32971461.

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