液相色譜儀的校準(zhǔn)方法

1. 液相色譜儀的概述

液相色譜儀是由輸液系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、檢測(cè)系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)等部分組成的分析儀器。液相色譜儀根據(jù)樣品中各組分在色譜柱內(nèi)固定相和流動(dòng)相間分配或吸附等特性的差異，由流動(dòng)相將樣品帶入色譜柱中進(jìn)行分離，經(jīng)檢測(cè)器檢測(cè)并通過(guò)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)記錄色譜圖，依據(jù)各組分的保留時(shí)間和響應(yīng)值(峰面積或峰高)進(jìn)行定性和定量分析。

2. 計(jì)量性能要求

(1)      輸液路接口緊密牢固，在規(guī)定的壓力范圍內(nèi)無(wú)泄漏。

(2)      泵流量設(shè)定值誤差和流量穩(wěn)定性應(yīng)符合下表的要求。

(3)      梯度最大允許誤差：士3%。

(4)      柱溫箱溫度設(shè)定值最大允許誤差：±2℃。

柱溫箱溫度穩(wěn)定性：不大于1℃/h。

(5)      該儀器的計(jì)量性能應(yīng)符合下表的要求：

3.計(jì)量器具校準(zhǔn)

（1）環(huán)境條件

室溫為（15~30）℃，校準(zhǔn)過(guò)程中溫度變化不超過(guò)3℃（對(duì)示差折光率檢測(cè)器，室溫變化不超過(guò)2℃），室內(nèi)相對(duì)濕度：（20~85）%；室內(nèi)不得存放易燃、易爆和強(qiáng)腐蝕性的物質(zhì)，無(wú)機(jī)械振動(dòng)和電磁干擾，通風(fēng)良好。

（2）校準(zhǔn)使用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

a.  萘-甲醇溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：認(rèn)定值為1.00×10^-4g/mL，擴(kuò)展不確定度小于4%， K=2；

b.  萘-甲醇溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：認(rèn)定值為1.00×10^-7g/mL，擴(kuò)展不確定度小于4%， K=2；

c.  甲醇中膽固醇溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：認(rèn)定值為200μg/mL，擴(kuò)展不確定度小于2.0%， K=2；

d.  甲醇中膽固醇溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：認(rèn)定值為5.0μg/mL，擴(kuò)展不確定度小于5.0%， K=2；

e.  膽固醇純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：認(rèn)定值為99.7%，擴(kuò)展不確定度小于0.1%， K=2。

（3） 液相色譜儀的校準(zhǔn)項(xiàng)目

1) 外觀檢測(cè)

2) 輸液系統(tǒng)

a.  泵耐壓

b.  泵流量設(shè)定值誤差

c.  泵流量穩(wěn)定性

d.  梯度誤差

3) 柱溫箱

a.  溫度設(shè)定值誤差

b.  溫度溫度性

4) 檢測(cè)器

a.  基線(xiàn)噪聲

b.  基線(xiàn)漂移

c.  最小檢測(cè)濃度

d.  波長(zhǎng)示值誤差和重復(fù)性

e.  線(xiàn)性范圍

5) 整機(jī)：定性、定量重復(fù)性

（4）外觀檢查

用目測(cè)、手動(dòng)法進(jìn)行檢查。

（5）輸液系統(tǒng)

a.  泵耐壓：將儀器各部分連接好，以100%甲醇(或純水)為流動(dòng)相，流量為0.2 mL/ min，按說(shuō)明書(shū)啟動(dòng)儀器，壓力平穩(wěn)后保持10 min，用濾紙檢查各管路接口處是否有濕跡。卸下色譜柱，堵住泵出口端(壓力傳感器以下)，使壓力達(dá)到最大允許值的90%，保持5 min應(yīng)無(wú)泄漏。

b.  泵流量設(shè)定值誤差和流量穩(wěn)定性：按要求設(shè)定好流量，啟動(dòng)儀器，壓力穩(wěn)定后，在流動(dòng)相出口處用事先稱(chēng)重過(guò)的潔凈容量瓶收集流動(dòng)相，同時(shí)用秒表計(jì)時(shí)，收集規(guī)定時(shí)間內(nèi)流出的流動(dòng)相，在分析天平上稱(chēng)重，計(jì)算流量實(shí)測(cè)值，重復(fù)測(cè)量3次。

c.  梯度誤差：由梯度控制裝置設(shè)置階梯式的梯度洗脫程序，A溶劑為純水，B溶劑為含0. 1%丙酮的水溶液。將輸液和檢測(cè)器連接(不接色譜柱)，開(kāi)機(jī)后以A溶劑沖洗系統(tǒng)，基線(xiàn)平穩(wěn)后開(kāi)始執(zhí)行梯度程序，畫(huà)出B溶劑經(jīng)由5段階梯從0%變到100%的梯度變化曲線(xiàn)。求出由B溶劑變化所產(chǎn)生的每一段階梯對(duì)應(yīng)的響應(yīng)信號(hào)值的變化值，重復(fù)測(cè)量2次，計(jì)算結(jié)果。

（6）柱箱溫度設(shè)定值誤差和穩(wěn)定性校準(zhǔn)

a.  將數(shù)字溫度計(jì)探頭固定在柱溫箱內(nèi)與色譜柱相同的部位，選擇35℃和45℃ (也可根據(jù)使用溫度設(shè)定)進(jìn)行校準(zhǔn)；

b.  按儀器說(shuō)明書(shū)操作，通電升溫，待溫度穩(wěn)定后，記下溫度計(jì)讀數(shù)并開(kāi)始計(jì)時(shí)，以后每隔10 min記錄1次讀數(shù)，共計(jì)7次，求出平均值。

c.  平均值與設(shè)定值之差為柱溫箱溫度設(shè)定值誤差，7次讀數(shù)中最大值與最小值之差為柱溫箱溫度穩(wěn)定性。

（7）檢測(cè)器校準(zhǔn)（以紫外-可見(jiàn)光檢測(cè)器和二極管陣列檢測(cè)器為例）

a.  波長(zhǎng)示值誤差和重復(fù)性

將檢測(cè)器和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)連接好，通電預(yù)熱穩(wěn)定后，用注射器將純水注入檢測(cè)池內(nèi)進(jìn)行沖洗后，充滿(mǎn)檢測(cè)池。待檢測(cè)器示值穩(wěn)定后，在(235土5) nm、(257士5) nm、(313士5) nm和(350士5) nm的波長(zhǎng)下將示值回零，然后再用注射器將紫外分光光度計(jì)溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(參考波長(zhǎng)為235 nm，257 nm，313 nm和350 nm)從檢測(cè)器入口注入樣品池中沖洗，并將樣品池充滿(mǎn)至示值穩(wěn)定。將檢測(cè)器波長(zhǎng)調(diào)到低于參考波長(zhǎng)5nm處(例如檢定257 nm時(shí)，檢測(cè)器波長(zhǎng)先調(diào)到252 nm)，改變檢測(cè)器波長(zhǎng)，每(5 ~10) s改變1 nm,記錄每個(gè)波長(zhǎng)下的吸收值，最大或最小吸收值對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)與參考波長(zhǎng)之差為波長(zhǎng)示值誤差。每個(gè)波長(zhǎng)重復(fù)測(cè)量3次，其中最大值與最小值之差為波長(zhǎng)重復(fù)性。

b.  基線(xiàn)噪聲和基線(xiàn)漂移

選用C₁₈色譜柱，以100%甲醇為流動(dòng)相，流量為1.0 mL/min，紫外檢測(cè)器的波長(zhǎng)設(shè)定為 254 nm，檢測(cè)靈敏度調(diào)擋。開(kāi)機(jī)預(yù)熱，待僅器穩(wěn)定后記錄基線(xiàn) 30min，選取基線(xiàn)中噪聲最大峰-峰高對(duì)應(yīng)的信號(hào)值，計(jì)算基線(xiàn)噪聲。

c.  最小檢測(cè)濃度

在基線(xiàn)噪聲和基線(xiàn)漂移的色譜條件下，由進(jìn)樣系統(tǒng)注入(10~ 20) μL的1.00×10-7g/mL萘-甲醇溶液，記錄色譜圖，由色譜峰高和基線(xiàn)噪聲峰高，計(jì)算最小檢測(cè)濃度。

d.  線(xiàn)性范圍

將檢測(cè)器和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)連接好，檢測(cè)器波長(zhǎng)設(shè)定為254 nm，通電穩(wěn)定后，用注射器直接向檢測(cè)池中注射2%異丙醇-水溶液沖洗檢測(cè)池至示值穩(wěn)定后，記下此值。然后，依照上法向檢測(cè)池中依次分別注入丙酮-2%異丙醇系列水溶液(丙酮含量為0.1%，0.2%，…，1.0%)，并記下各溶液對(duì)應(yīng)的穩(wěn)定響應(yīng)信號(hào)值，每個(gè)溶液重復(fù)測(cè)量3次，取算術(shù)平均值。以5個(gè)丙酮溶液濃度(0.1%，0.2%，0.3%， 0.4%，0.5%)和對(duì)應(yīng)的響應(yīng)信號(hào)值做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，在曲線(xiàn)上找出丙酮溶液濃度大于0. 5%各點(diǎn)的讀數(shù)，與相應(yīng)各濃度點(diǎn)的測(cè)量值做比較，量值相差5%時(shí)的依度作為檢測(cè)上限。按得到的最小檢測(cè)濃度為檢測(cè)下限，他們的比值即為線(xiàn)性范圍。

（8）定性和定量重復(fù)性校準(zhǔn)

將儀器各部分聯(lián)接好，選用C₁₈色譜柱，用100%甲醇為流動(dòng)相，流量為1.0mL/min，根據(jù)儀器配置的檢測(cè)器，選擇相應(yīng)的測(cè)量參數(shù)如紫外可見(jiàn)光檢測(cè)器和二極管陣列檢測(cè)器波長(zhǎng)設(shè)定為254 nm，靈敏度選擇適中，基線(xiàn)穩(wěn)定后由進(jìn)樣系統(tǒng)注入一定體積的1.0×10^-4 g/mL萘-甲醇溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，其他檢測(cè)器選擇相應(yīng)的參數(shù)。連續(xù)測(cè)量6次，記錄色譜峰的保留時(shí)間和峰面積，最后計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

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