步驟1：擴(kuò)增DNA段，作為焦磷酸測序模板的單鏈?zhǔn)巧锼貥?biāo)記的。變性后，分離生物素標(biāo)記的單鏈PCR擴(kuò)增子，與測序引物雜交。雜交的引物和單鏈模板同各種酶一起將檢測和定量基因突變整合入一個(gè)強(qiáng)有力的體系，使用焦磷酸測序技術(shù)，相較于其他基于測序的方案在分析靶向短鏈DNA序列時(shí)，PyroMark平臺(tái)表現(xiàn)更卓yue。在表觀遺傳學(xué)研究中分析甲基化狀態(tài)，焦磷酸測序技術(shù)可高重復(fù)性的定量甲基化頻率，包括單個(gè)或連續(xù)的CpG位點(diǎn)，并可檢測和定量甲基化水平的微小變化。

對于遺傳檢測應(yīng)用，焦磷酸測序技術(shù)可準(zhǔn)確定量等位基因的可變位點(diǎn)，且很容易解決雜合性問題。 對于微生物鑒定和抗性分型，焦磷酸測序技術(shù)能夠同時(shí)分析多個(gè)樣本的常見的藥物抗性突變的。

原理

焦磷酸測序技術(shù)基于邊合成邊測序的原理，數(shù)分鐘內(nèi)可獲得定量數(shù)據(jù)。PyroMark Q96 ID是提供實(shí)時(shí)序列信息的完整體系，高度適用于檢測遺傳變異、遺傳定量和短鏈DNA測序。以下的產(chǎn)品可配合PyroMark Q96 ID儀器使用：PyroMark Q96 Vacuum Workstation、PyroMark CpG SW、PyroMark Assay Design SW、PyroMark IdentiFire SW、PyroMark Gold Q96 Reagents和PyroMark Control Oligo。同時(shí)提供樣本制備方案，可使用PyroMark Q96 Vacuum Workstation制備單鏈DNA。

焦磷酸測序反應(yīng)步驟：

孵育，包括DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶、三磷酸腺苷雙磷酸酶以及底物腺苷酰硫酸（APS）和熒光素。

步驟2：脫氧核苷三磷酸（dNTP）加入反應(yīng)中，在DNA聚合酶的作用下，dNTP結(jié)合到DNA鏈上與其互補(bǔ)的堿基位。每次結(jié)合都會(huì)釋放與核苷酸相等摩爾量的焦磷酸（PPi）。

步驟3：在有APS的條件下，ATP硫酸化酶將PPi轉(zhuǎn)化為ATP。在這個(gè)ATP的驅(qū)動(dòng)下，熒光素酶將熒光素轉(zhuǎn)化為氧化熒光素，并產(chǎn)生可見光，可見光的量與ATP的量成正比。通過電荷耦合（CCD）相機(jī)即可檢測到熒光素酶催化反應(yīng)產(chǎn)生的可見光，并在原始數(shù)據(jù)輸出（Pyrogram）中顯示為一個(gè)峰，每個(gè)峰的高度（光信號(hào)）與結(jié)合的核苷酸數(shù)量成正比。

步驟4：三磷酸腺苷雙磷酸酶，是一種核苷酸降解酶，會(huì)降解未結(jié)合的核苷酸與ATP。*降解后，加入另一個(gè)核苷酸。

步驟5：持續(xù)添加dNTP。α-硫代脫氧腺苷三磷酸（dATPαS）在反應(yīng)中用于替代天然脫氧腺苷三磷酸（dATP），這是因?yàn)镈NA聚合酶可高效的應(yīng)用前者，而不被熒光素酶識(shí)別。當(dāng)該過程連續(xù)進(jìn)行時(shí)，就會(huì)形成互補(bǔ)的DNA鏈，可根據(jù)Pyrogram追蹤的信號(hào)峰確定核苷酸序列。

簡化的工作流程—從樣本到結(jié)果

多功能PyroMark Q96 ID與表觀遺傳和遺傳分析流程無縫接合，且與QIAGEN良好的樣本制備、亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化和PCR擴(kuò)增技術(shù)兼容。借助于高度可靠的儀器可在序列水平上對SNP、插入和缺失、CpG位點(diǎn)的檢測以及生成序列信息。簡化的工作流程可更快速地獲得結(jié)果。

快速方便的樣本制備

從PCR產(chǎn)物到直接用于測序的單鏈模板，應(yīng)用PyroMark Q96 Vacuum Workstation可在15分鐘內(nèi)同時(shí)制備96個(gè)樣本。該工作站操作簡單，且手工操作時(shí)間少于5分鐘。

流程

快速方便的樣本制備

從PCR產(chǎn)物到直接用于測序的單鏈模板，應(yīng)用PyroMark Q96 Vacuum Workstation可在15分鐘內(nèi)同時(shí)制備96個(gè)樣本。該工作站操作簡單，且手工操作時(shí)間少于5分鐘。

在焦磷酸測序之前，形成了一個(gè)生物素標(biāo)記的PCR產(chǎn)物，該產(chǎn)物結(jié)合到覆蓋鏈酶親和素的瓊脂糖凝膠珠上。這些膠珠會(huì)被真空儀器捕捉并*清洗，隨后變性，得到適合于焦磷酸測序的單鏈DNA。該模板DNA放入含測序引物的焦磷酸測序反應(yīng)板中，隨后引物退火，再將該板放入PyroMark儀器中即可。PyroMark Gold試劑包含用于焦磷酸測序反應(yīng)的酶、核苷酸和底物，將這些試劑移入分配卡夾，按照軟件中提供的體積試被加入儀器中，用于焦磷酸測序。