蛋白質(zhì)純化實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)

蛋白質(zhì)純化簡(jiǎn)介:

蛋白純化要利用不同蛋白間內(nèi)在的相似性與差異，利用各種蛋白間的相似性來(lái)除去非蛋白物質(zhì)的污染，而利用各蛋白質(zhì)的差異將目的蛋白從其他蛋白中純化出來(lái)。每種蛋白間的大小形狀、電荷、疏水性、溶解度和生物學(xué)活性都會(huì)有差異，利用這些差異可將蛋白從混合物如大腸桿菌裂解物中提取出來(lái)得到重組蛋白。

蛋白質(zhì)純化的實(shí)驗(yàn)方法:

蛋白的純化大致分為粗分離階段和精細(xì)純化階段二個(gè)階段。一般蛋白純化采用的方法為樹(shù)脂法。粗分離階段主要將目的蛋白和其他細(xì)胞成分如DNA、RNA等分開(kāi)，由于此時(shí)樣本體積大.成分雜，要求所用的樹(shù)脂高容量、高流速、顆粒大、粒徑分布寬.并可以迅速將蛋白與污染物分開(kāi)，必要時(shí)可加入相應(yīng)的保護(hù)劑(例如蛋白酶抑制劑)。防止目的蛋白被降解。精細(xì)純化階段則需要更高的分辨率，此階段是要把目的蛋白與那些分子量大小及理化性質(zhì)接近的蛋白區(qū)分開(kāi)來(lái)，要用更小的樹(shù)脂顆粒以提高分辨率，常用離子交換柱和疏水柱，應(yīng)用時(shí)要綜合考慮樹(shù)脂的選擇性和柱效兩個(gè)因素。選擇性指樹(shù)脂與目的蛋白結(jié)

合的特異性，柱效則是指各蛋白成分逐個(gè)從樹(shù)脂上集中洗脫的能力，洗脫峰越窄，柱效越好。僅有好的選擇性，洗脫峰太寬，蛋白照樣不能有效分離。

蛋白的表達(dá):

是指通過(guò)模式生物來(lái)表達(dá)目的的外源基因蛋白的一種現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，表達(dá)系統(tǒng)主要是由宿主、外源基因、載體和輔助

成分組成，從而實(shí)現(xiàn)外源基因通過(guò)載體在宿主中的表達(dá)。

實(shí)驗(yàn)意義:

1.蛋白表達(dá)技術(shù)在基因工程技術(shù)中占有核心地位，在實(shí)際生產(chǎn)中具有重要的應(yīng)用意義。

2.蛋白表達(dá)技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物學(xué)各個(gè)具體領(lǐng)域,特別是體內(nèi)的功能研究和蛋白質(zhì)的大規(guī)模生產(chǎn)都需要應(yīng)用。

實(shí)驗(yàn)原理:

1.獲得目的基因;

2.構(gòu)建合適的載體(注意根據(jù)目的基因和純化方式的選擇等多方面因素選擇融合標(biāo)簽) ;

3.將目的基因插入表達(dá)載體中。并通過(guò)測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證；

4.載體轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌等宿主菌后，測(cè)序篩選挑單克隆菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，IPTG誘導(dǎo)靶蛋白的表達(dá)；

5.破碎菌體后提取蛋白。并通過(guò)融合標(biāo)簽純化得到靶蛋白。

分類(lèi):

1.真核表達(dá)系統(tǒng):真核表達(dá)系統(tǒng)主要有昆蟲(chóng)表達(dá)系統(tǒng)、酵母表達(dá)系統(tǒng)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)，其中酵母表達(dá)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞較為常見(jiàn)。

2.無(wú)細(xì)胞體外表達(dá)系統(tǒng)，又稱(chēng)為體外翻譯系統(tǒng)，通過(guò)模擬細(xì)胞的生命活動(dòng)和現(xiàn)象來(lái)重現(xiàn)胞內(nèi)蛋白的轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程。

結(jié)果展示:

原核表達(dá)系統(tǒng)

真核表達(dá)系統(tǒng)

無(wú)細(xì)胞體外表達(dá)系統(tǒng)

Reaction temperature (C)

實(shí)驗(yàn)周期及交付標(biāo)準(zhǔn):

1.實(shí)驗(yàn)周期: 4-6周

2.交付標(biāo)準(zhǔn):目的蛋白、實(shí)驗(yàn)報(bào)告(試劑、 耗材、實(shí)驗(yàn)步驟)、原始數(shù)據(jù)等。

需確認(rèn)的信息:

1.表達(dá)系統(tǒng)采取方式。

2.純化步驟選擇。