| 應用領域 | 醫(yī)療衛(wèi)生,生物產業(yè) |
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TUNEL凋亡顯色法
TUNEL (TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)法檢測細胞凋亡的原理是當細胞發(fā)生凋亡時，DNA內切酶被激活，核小體間的基因組DNA被切斷，暴露的3'-OH可以在末端脫氧核苷酸轉移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT)加上帶有生物素(Biotin) 標記的dUTP即Bitin-dUTP.,隨后于辣根過氧化物酶 (HRP) 標記的streptavidin結合， 在HRP的催化下通過DAB顯色來顯示凋亡細胞,從而可以通過普通光學顯微鏡檢測到細胞凋亡。
實驗意義
1. TUNEL法是一種分子生物學 與形態(tài)學相結合的研究方法，可對完整的單個凋亡細胞或者凋亡小體進行原位染色，可以準確反映細胞凋亡最典型的生物化學和形態(tài)特征。
2.石蠟/冰凍切片TUNEL凋亡可用于石蠟切片冰凍切片培養(yǎng)的細胞等進行細胞凋亡檢測，靈敏度遠比一般的組織化學和生物化學方法要高。
3.操作簡便快捷，在細胞凋亡的研究中被廣泛采用。
實驗步驟
1.石蠟切片TUNEL顯色法:
①石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，脫蠟劑二甲苯，至水劑乙醇;
②PBS漂洗3*5 min; .
③加入蛋白酶K工作液37°C反應15-30 min, PBS漂洗3x5 min;
④4%多聚甲醛(pH7 .4的PBS)室溫固定15-30 min, PBS漂洗3x5 min;
⑤浸入封閉液(3%H202)室溫封閉10 min, PBS漂洗3x5 min;
⑥加入適量TdT酶反應液，暗濕盒中37°C反應1 h,用SSC室溫15 min終止反應后,PBS漂洗3x5 min; .
⑦浸入0.3% H202封閉內源性過氧化物酶活性，室溫孵育3-5 min, PBS漂洗3x5 min;
⑧滴加Streptavidin-HRP工作液，37*C反應30-60 min, PBS漂洗3x5 min;
⑨滴加DAB顯色液后用去離子水漂洗數(shù)次;
10.選擇是否用DAPI復染細胞核;
脫水、透明、中性樹膠封片后進行觀察。
2.冰凍切片TUNEL顯色法:
①新鮮組織經(jīng)處理后，立即在恒冷冰凍切片機內切片，厚度為5~6 um;
②防脫玻片，貼片，室溫陰干約12 h;
③4%多聚甲醛(pH7 4的PBS)室溫固定10 min, PBS漂洗3x5 min;
④浸入封閉液(3%H202)室溫封閉10 min, PBS漂洗3x5 min;
⑤浸入邇透液(0.1% Triton X-100溶于PBS中)，室溫通透30 S-2 min;
⑥加入適量TdT酶反應液，暗濕盒中37°C反應1 h,用SSC室溫15 min終止反應后，PBS漂洗3x5 min; .
⑦浸入0.3% H2O2封閉內源性過氧化物酶活性，室溫孵育3-5 min, PBS漂洗3x5 min;
⑧滴加Streptavidin-HRP工作液，379C反應30-60 min, PBS漂洗3x5 min;
⑨滴加DAB顯色液后用去離子水漂洗數(shù)次:
@選擇是否用DAPI復染細胞核;
脫水、透明、中性樹膠封片后進行觀察。
石蠟/冰凍切片TUNEL凋亡實驗完成周期及交付標準
1.實驗周期: 1-2周
2.交付標準:蠟塊、切片、染色圖片.實驗報告(實驗步驟、試劑、耗材等)
需確認的信息
1.樣本的種屬.
2.樣本的類型(固定的組織or蠟塊or切片)
3.是否提供試劑盒
4.拍照要求
收費標準服務周期提供結果:
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