SeeDB實現(xiàn)生物體樣本深層成像

　　今井猛博士等人開發(fā)了一種對于水溶性生物體組織的形態(tài)和組成在不破壞熒光蛋白以及熒光神經(jīng)同位素的條件下,可快捷簡便地使大腦等生物體組織透明化的方法——SeeDB。SeeDB由水、果糖、還原劑構成。

　　SeeDB法是在使用共聚焦顯微鏡和雙光子激發(fā)顯微鏡下可深層成像的方法。可利用熒光蛋白和神經(jīng)示蹤劑，實現(xiàn)對熒光神經(jīng)回路的全貌闡明和定量分析等各種各樣的應用。

◆SeeDB protocol案例

　　SeeDB法，可用于脊椎動物的各種組織，下面以小鼠大腦為例進行介紹。

１．固定

①　將小鼠大腦在4%多聚甲醛/PBS，4℃下固定過夜。

②　樣本用PBS清洗三次（每次清洗10分鐘）

２．透明化處理

③　將樣品加入放有20 mL的SeeDB:20 w/v%果糖溶液的50 mL錐形瓶中。

　　在室溫下在旋轉(zhuǎn)器中旋轉(zhuǎn)4-8小時（約4 rpm）

　　在脆弱的樣本和薄片情況也可以用壓板式搖床（約17 rpm）

④　將樣本加入放有SeeDB:40 w/v%果糖溶液的50 mL錐形管中，室溫下旋轉(zhuǎn)4-8小時。

⑤　將樣本加入放有SeeDB:60 w/v%果糖溶液的50 mL錐形管中，室溫下旋轉(zhuǎn)4-8小時。

⑥　將樣本加入放有SeeDB:80 w/v%果糖溶液的50 mL錐形管中，室溫下旋轉(zhuǎn)12小時。

⑦　將樣本加入放有SeeDB:100 w/v%果糖溶液的50 mL錐形管中，室溫下旋轉(zhuǎn)12小時。

⑧　將樣本加入放有SeeDB的50 mL錐形管中，室溫下旋轉(zhuǎn)24小時。

   　長時間可延長至48小時。在透明化成功時，透光可觀察到組織透明化。

３．觀察

⑨　將SeeDB處理過的大腦樣本置于共聚焦顯微鏡或雙光子激發(fā)顯微鏡下觀察。

（注意點）

　　樣本用SeeDB液固定。用SeeDB透明化處理后的樣本折射率可達到1.49。因此，物鏡中應該有甘油浸沒透鏡、油鏡、透明化用鏡片，即使浸水鏡頭到達2 mm深度也是沒有問題的。浸沒式鏡片請使用浸沒液，SeeDB不能用作浸沒液。在使用干式鏡頭（折射率1.0）和浸水鏡頭（折射率1.33）獲取畫像情況下，需要補正深度值（補正值請參考相關文獻）。

SeeDB　處理案例

SeeDB生物體樣本透明化

左起依次為經(jīng)SeeDB液透明化處理的小鼠幼胎（幼胎12天）

新生鼠（生后3天）的全腦、成鼠大腦（8周齡，厚度2 毫米）

SeeDB　觀察案例

雙光子激發(fā)顯微鏡下的Thy1-YFP-H小鼠

（10周齡）大腦熒光成像

使用Olimpus公司產(chǎn)品

多光子物鏡：XLSLPLN25XGMP觀察案例

比例尺：100 微米

小鼠大腦固定后用Dil標記，SeeDB透明化處理案例   

左：嗅球僧帽細胞樹突（橫向觀察）

右：嗅球僧帽細胞樹突（縱向觀察）

使用Olympus公司產(chǎn)品

有機硅浸沒型物鏡：UPLSAPO 20X觀察案例。比例尺：100 微米。

SeeDB實現(xiàn)生物體樣本深層成像