DH10Bac 感受態(tài)細(xì)胞說(shuō)明書(shū)

（Rev.A）

保 存：-80℃保存，運(yùn)輸為干冰包裝。自收貨之日起液氮保存至少一年，-80℃保存至少 6 個(gè)月。

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

大腸桿菌DH10 Bac感受態(tài)細(xì)胞是經(jīng)特殊工藝制備的，適用于昆蟲(chóng)桿狀病毒Bac-to-Bac系統(tǒng)中同源重組的菌株，用于產(chǎn)生重組Bacmid。使用pFastbacHTA質(zhì)粒檢測(cè)，轉(zhuǎn)化效率zui高可達(dá)2×10⁷CFU/ug，-80°C 保存幾個(gè)月轉(zhuǎn)化效率不發(fā)生改變。

基因型：F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80lacZΔM15 ΔlacX74 recA1 endA1 araD139 Δ (ara,leu)7697 galU galK λ- rpsL nupG /pMON14272 / pMON7124

產(chǎn)品特點(diǎn)：
DH10Bac 細(xì)胞包含親本 Bacmid bMON14272 和輔助質(zhì)粒 pMON7124。親本 Bacmid 包含一個(gè) mini-F 復(fù)制子、卡那霉素抗性基因、 Tn7 位點(diǎn)和 lac Z α-互補(bǔ)因子。att輔助質(zhì)粒包含 tns ABCD 區(qū)域，該區(qū)域提供了 mini-Tn7從供體質(zhì)粒插入親本 Bacmid 靶位點(diǎn)所需要的轉(zhuǎn)座蛋白。供體如 pFastBac 系列質(zhì)粒（pFastBac1，pFastBac Dual等）含有 Tn7R 和 Tn7L 同源重組臂，Tn7R 和 Tn7L 之間包含慶大霉素抗性基因、昆蟲(chóng)病毒多角體基因啟動(dòng)子、多克隆位點(diǎn)和 SV40 病毒的 PolyA 加尾信號(hào)。當(dāng)含有靶基因pFastBac 的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到 DH10Bac 細(xì)胞后，發(fā)生重組后就可產(chǎn)生重組 Bacmid，提取純化重組 Bacmid 轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞 Sf9 或 Sf21 就可以包裝產(chǎn)生昆蟲(chóng)病毒。

此外，DH10Bac 細(xì)胞中的 The φ80dlacZDM15 基因的產(chǎn)物可以實(shí)現(xiàn)β-半乳糖苷酶的α-互補(bǔ)現(xiàn)象，用于重組bacmid 的藍(lán)白斑篩選。

操作步驟（以下操作均按無(wú)菌條件的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行）：
制備含下面抗生素的 LB 固體平板：50 μg/ml kanamycin、7 μg/ml gentamicin、10 μg/ml tetracycline、100 μg/ml X-gal、40 μg/ml IPTG。
1.  取感受態(tài)細(xì)胞置于冰浴中，如需分裝可將剛?cè)诨?xì)胞懸液分裝到無(wú)菌預(yù)冷的離心管中，置于冰浴中。一次轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的建議用量為 50-100 μl ，可以根據(jù)實(shí)際情況分裝使用。應(yīng)注意所用 DNA 體積不要超過(guò)感受態(tài)細(xì)胞懸液體積的十分之一。以下實(shí)驗(yàn)以 100 μl 感受態(tài)細(xì)胞為例。
2.  向感受態(tài)細(xì)胞懸液中加入 1-10 ng 重組質(zhì)粒，輕輕旋轉(zhuǎn)離心管以混勻內(nèi)容物，在冰浴中靜置 30 分鐘。
3.  將離心管置于 42 ℃ 水浴中放置 90 秒，然后快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細(xì)胞冷卻 2 分鐘，該過(guò)程不要搖動(dòng)離心管。
4.  向每個(gè)離心管中加入 900 μl 無(wú)菌的 SOC（不含抗生素），混勻后置于 37 ℃ 200 rpm，搖床振蕩培養(yǎng) 4 小時(shí)。
5.  用 SOC 培養(yǎng)基進(jìn)行 10 倍梯度稀釋，如分成 3 個(gè)稀釋梯度 10^-1, 10^-2, 10^-3
6.  取 100 μl 的各個(gè)梯度的培養(yǎng)物用于涂布。等平板中的液體*吸收后，倒置平板，37℃培養(yǎng) 24-48 小時(shí)。
7.  保留剩余的菌液于 4℃冰箱中，視平板上菌落生長(zhǎng)情況決定去留。

相關(guān)試劑及培養(yǎng)基的制備方法:
1. SOB 和 SOC 培養(yǎng)基：稱取 20g 胰蛋白胨 ，5g 酵母粉 ，0.5g NaCl置于 1L 燒杯中加入約 800ml 的去離子水，*溶解后再補(bǔ)加 10ml 250 mM KCl 溶液，滴加 5M NaOH（約 0.2ml）調(diào) pH 值 7.0。 加入去離子水將培養(yǎng)基定容至 1L。121℃高溫高壓滅菌15min。使用時(shí)加入 5ml 滅菌的 2M MgCl₂ 溶液（此種培養(yǎng)基稱為SOB）。再補(bǔ)加經(jīng) 0.22 μm 過(guò)濾除菌的 1M 葡萄糖溶液 2ml（此種培養(yǎng)基為 SOC）。
2. 轉(zhuǎn)化復(fù)蘇細(xì)菌用的液體 SOC 培養(yǎng)基：可以一次高壓 50ml 液體培養(yǎng)基，無(wú)菌狀態(tài)按 1ml 每管分裝于高壓滅菌的 1.5ml 離心管中，裝于自封袋中，凍存于-20℃中，每次用一支?？梢?地避免培養(yǎng)基污染和減少勞動(dòng)量。
3. LB 固體選擇培養(yǎng)基：100ml LB 液體培養(yǎng)基中加入 1.5 g 瓊脂粉，搖勻后，121℃高壓滅菌 20 分鐘。冷卻至 50℃左右時(shí)加入相應(yīng)濃度的抗生素（如 氨芐青霉素，濃度通常為 100μg/ml），混勻后倒在細(xì)菌用的無(wú)菌培養(yǎng)皿中，等瓊脂凝固后即可使用。
4. IPTG：稱量 1.9g IPTG（MW=238.31）充分溶解于 40 ml 滅菌水，濃度為 200mmol/L。用無(wú)菌 0.22 μm過(guò)濾膜過(guò)濾除菌。小份分裝后，-20℃保存。
5. X-gal：用 DMF（二甲基甲酰胺）配制成 20 mg/ml，小份分裝（1 ml/份）后，-20℃避光保存。

注意事項(xiàng)：

1. 感受態(tài)細(xì)胞應(yīng)保存在-80℃，不可反復(fù)凍融，否則其轉(zhuǎn)化效率將會(huì)降低。
2. 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)嚴(yán)格無(wú)菌操作，防止其它 DNA 或雜菌的污染，避免為以后的篩選、鑒定帶來(lái)影響。
3. 轉(zhuǎn)化時(shí)，轉(zhuǎn)化效率與外源 DNA 的濃度在一定范圍內(nèi)成正比，但當(dāng)加入的外源 DNA 量過(guò)多或體積過(guò)大反而會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率。轉(zhuǎn)化時(shí) DNA 體積要小于感受態(tài)細(xì)胞體積的十分之一。
4. 轉(zhuǎn)化率的計(jì)算：轉(zhuǎn)化率＝產(chǎn)生菌落的總數(shù)/鋪板 DNA 總量。
5. 為防止轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)不成功，可以保留部分連接產(chǎn)物，以重新轉(zhuǎn)化，將損失降到zui低。

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